L' échange isotopique hydrogène/deutérium et la spéctrométrie de masse pour l'étude d'interactions protéine-protéine

Hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry for the structural study of protein interactions

• Auteur / Autrice : Alexis Nazabal
• Direction : Jean-Marie Schmitter
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences. Chimie analytique
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Bordeaux 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromatographie en phase liquide

Saccharomyces cerevisiae

ATPases

Spectrométrie de masse

Résumé

Le travail de thèse est consacré au développement et à l'application d'une méthodologie qui permet d'obtenir par spectrométrie de masse des informations sur la façon dont les sous unités d'un complexe protéique sont agencée ainsi que sur la conformation adopté par les sous-unités. La méthodologie utilisée est basée sur le remplacement des hydrogène amides mobiles des liaisons peptidiques lors de la mise en présence séquentielle des protéines dans de l'eau lourde et de l'eau légère. Le temps qu'il faut pour réaliser ces échanges varie avec l'accessibilité des hydrogènes et leur engagement plus ou moins poussé dans les liaison hydrogènes. Pour mesurer ces temps nécessaire à l'échange en divers points de la protéine, il faut soumettre celle-ci à une digestion enzymatique qui génère des peptides dont la masse moléculaire est mesurée dans des expériences de couplage chromatographie-spectrométrie de masse (LC-MS). On différentie ainsi les zones de la protéine en terme d'accessibilité différentes et de structure 3D différentes. Le manuscrit présente ensuite un travail de mise au point de la méthodologie sur la sous-unité e du complexe F1 ATPase de Saccharomyces Cerevisiae. Les interactions de la sous unité e ont été étudiées. Cette partie à permis de mettre au point une méthode de micro-chromatographie ZIPTIP qui nécessite des quantités de matériel très réduite par rapport aux méthodes décrites dans la littérature. Cette partie à donc permis d'évaluer la pertinence de l'approche pour l'étude des interactions au sein d'un complexe hétéro-oligomérique par échange H/D. La méthodologie a ensuite été utilisé pour l'étude structurale de la protéine prion HET-s de Podospora Anserina. L'étude par LC-MS à nano-débit à permis de déterminer les taux d'échange pour 87% de la séquence peptidique. L'interprétation des résultat montre une forte diminution de l'incorporation de deutérium dans la partie C-terminale de la protéine lorsque celle-ci est agrégée en fibre amyloi͏̈des ce qui suggère que la partie 240-295 de la protéine HET-s est fortement impliquées dans les interactions au sein de la fibre amyloi͏̈de.

We have evaluate the ability of hydrogen/deuterium exchange of amide protons followed by mass spectrometry (HXMS) to yield topological information about supramolecular protein complexes, this approach has been tested with the 370Kda hetero-oligomeric complex of yeast F1-ATPase. The study was focused on the e subunit (6612 da) of the complex. Deuterium back exchange due to the chromatographic isolation step of this subunit was strongly reduced by means of fast micro-chromatography, and MALDI-MS was used to analyse either the intact subunit or peptide mixtures resulting from its proteolytic cleavage. A deuterium labeling kinetic study was conducted with e subunit being a part of the F1 native complex. The effect of a secondary structure was also investigated by means of HXMS on the isolated e subunit. Finally, to determine wich regions of the e subunit are accessible to solvent in F1-ATPase during exchange, the complex was submitted to hydrogen/deuterium exchange, the e subunit was purified by micro-chromatography, digested by pepsin, and resulting peptidesfragments were analyzed by MALDI MS. The second part of the study was dedicaded to the protein prion HET-s of Podospora Anserina. HET-s aggregates into amyloid fibers in vitro. Such fibers obtained in vitro are infectious, indicating that [HET-s] prion can propagate as a self-perpetuating amyloid aggegate of the HET-s protein. Previous analyses have suggested that only a limited region of the HET-s protein is involved in amyloid formation and prion propagation. In a first step, a peptide mass fingerprint of the protein was obtained, leading to 87% coverage of the HET-s primary structure. Amyloid aggregates of HET-s were obtained, and H/D exchange was monitored on the soluble and on the amyloid form of HET-s. This study revealed that in the soluble of HET-s, the C-terminal region (spanning from residues 240-289) displays a high solvent accessibility. In sharp contrast, solvent accessibility is drastically reduced in that region in the amyloid form. H/D exchange rates and levels in the N-terminal part of the protein (residues 1-220) are comparable in the soluble and the aggregated state. These results indicate that amyloid aggregation of HET-s involves a conformational transition of the C-terminal part of the protein from a mainly disordered to an aggregated state in wich this region is highly protected from hydrogen exchange.