Recherche Avancée

Thèse soutenue

Ingénierie rationnelle de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea : de la structure tri-dimensionnelle aux bases moléculaires de la catalyse

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Auteur / Autrice : Cécile Albenne
Direction : Magali Remaud
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie - Santé. Biotechnologie
Date : Soutenance en 2002
Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Résumé

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L'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (AS) est une transglucosidase de la famille 13 des glycoside-hydrolases qui utilise le saccharose pour synthétiser un homopolymère de type amylose et glucosyler très efficacement des accepteurs tels que le glycogène. L'obtention et l'analyse de complexes enzyme : substrat couplée à des expériences de mutagénèse dirigée, nous ont permis de montrer que la spécificité vis-à-vis du saccharose est conférée par des résidus du sous-site -1 (Asp144, Arg509, Tyr147 et Phe250). Les résidus du sous-site +1 (Asp394 et Arg446) assurent un positionnement correct des molécules acceptrices et sont responsables de la spécificité de synthèse mais aussi de rupture des liaisons a-1,4. En effet, nous avons révélé la capacité de l'AS à disproportionner efficacement les maltooligosaccharides de DP > 4, la présence d'un sous-site +4 fort (Arg415), associé à des sous-sites +1, +2 et +3 faibles (résidu Arg226 gênant), réduisant fortement l'accès au site actif des plus petites molécules. Une analyse approfondie des réactions catalysées en présence de saccharose seul nous a ensuite permis de démontrer que la formation du polymère résulte d'une élongation non-processive des maltooligosaccharides produits par l'AS, du côté de leur extrémité non-réductrice. Alors que les produits < DP4 sont accumulés du fait d'une fixation défavorable au niveau des sous-sites +1 à +3, la glucosylation des longues chaînes repose sur un arrimage performant au niveau de différents sites positionnés à la surface de l'enzyme. Enfin, un site secondaire, non catalytique, de fixation du saccharose a été révélé et pourrait être responsable du comportement cinétique atypique de l'AS, via de possibles modifications conformationnelles. Une étude de modélisation moléculaire a été initiée pour explorer l'éventualité d'une voie de passage pour le saccharose entre le site secondaire et le site actif. La modélisation a également permis de proposer une solution d'arrimage du glycogène, révélant une complémentarité de forme entre l'enzyme et cet accepteur