Mise en évidence du rôle des isoenzymes I et II de la pyruvate carboxylase dans le métabolisme central, chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Function of pyruvate carboxylase isoenzymes I and II in the central metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : Carine Huet-Velasco
• Direction : Jean-Marie François
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie, santé, biotechnologies. Microbiologie
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ligases

Saccharomyces cerevisiae

Cycle de Krebs

Métabolisme

Glucose

Acides aminés

Isoenzymes

Azote -- Métabolisme

Mots clés libres

Pyruvate carboxylase

Résumé

La pyruvate carboxylase est une enzyme clé du métabolisme central des eucaryotes. Elle catalyse la réaction de carboxylation du pyruvate en oxaloacétate, et constitue ainsi une voie anaplérotique essentielle du cycle du citrate. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae il existe 2 isoenzymes cytosoliques de la pyruvate carboxylase, PC I et PC II, codées par deux gènes homologues, PYC1 et PYC2. Notre objectif est de trouver des conditions qui permettraient de différencier ces 2 isoformes afin de déterminer leur fonction respective. L'analyse des propriétés cinétiques montre que PC I est dépendante de l'acétyl-CoA alors que PC II est quasiment insensible à cet effecteur et l'affinité de PC I pour l'ATP est 10 fois inférieure à celle de PC II. PC I semble l'isoenzyme majeure sur glucose/ammonium car la délétion de PYC1 ralentit la croissance de la levure alors que la délétion de PYC2 n'a pas de phénotype et l'activité PC I dans un mutant delta pyc2 est 2 fois supérieure à l'activité PC II dans un mutant delta pyc1. Dans ce travail, nous montrons que PYC1 et PYC2 sont régulés de manière différentielle par la nature de la source d'azote du milieu de croissance. Des régions promotrices de PYC1 semblent impliquées dans le mécanisme de répression de PYC1 en présence d'aspartate et de glutamate. Les rapports de concentration entre l'alpha-cétoglutarate, la glutamine et le glutamate intracellulaires pourraient être des signaux du contrôle de PYC1 par la nature de la source d'azote. PC I, isoenzyme majoritaire régulée par la nature des nutriments, est requise pour les réactions de biosynthèses alors que PC II aurait une activité anaplérotique de relai pour que la cellule puisse toujours répondre à ses besoins en oxaloacétate.

Pyruvate carboxylase is a key enzyme of the central metabolism in eucaryotes. It catalyzes the reaction of pyruvate carboxylation into oxaloacetate, an essential anaplerotic pathway of the citrate cycle. In the yeast Saccharomyces cerevisiae there are 2 pyruvate carboxylase cytosolic isoenzymes, PC I and PC II, encoded by 2 homologous genes, PYC1 and PYC2. We aim at finding conditions which could allow us to differentiate these 2 isoforms in order to determine their repective function. Analysis of kinetic properties shows that PC I is dependent on acetyl-CoA, whereas PC II is almost insensitive to this effector and the affinity of PC I for ATP is 10 times lower than that of PC II. PC I seems to be the major isoform on glucose/ammonium because the deletion of PYC1 slows down the growth of the yeast, whereas deletion of PYC2 has no phenotype and PC I activity in a delta pyc2 mutant is 2 times higher than PC II activity in a delta pyc1 mutant. In this study, we demonstrate that PYC1 and PYC2 are differentially regulated by the nature of the nitrogen source of the growth medium. Promoter regions of PYC1 seem to be concerned by the repression mecanism in the presence of aspartate and glutamate. The concentration ratios between intracellular alpha-cétoglutarate, glutamine and glutamate could be signals for control of PYC1 by the nature of nitrogen source. PC I, major isoenzyme regulated by the nature of nutrients, is required for biosynthesis pathways whereas PC II seems to have an auxiliary anaplerotic function to provide oxaloacetate to the cell, when needed.