Étude des changements conformationnels liés aux interactions homotropes et hétérotropes assurant la régulation de l'activité de l'aspartate transcarbamylase d'Escherichia coli

Study of the conformational changes linked to the homotropic and heterotropic interactions responsible for the regulation of the activity of E. Coli aspartate transcarbamylase

• Auteur / Autrice : Patrick Tauc
• Direction : Guy Hervé
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences naturelles
• Date : Soutenance en 1987
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)
• Jury : Président / Présidente : Jeannine Yon-Kahn
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jeannine Yon-Kahn, Jacques Ricard, Jean-Renaud Garel, Patrice Vachette, Jean-Claude Brochon, Guy Hervé
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jacques Ricard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rayons X -- Diffusion

Nucléotides

Tryptophane

Allostérie

Escherichia coli

Transférases

Mots clés libres

Changement conformationnel

Aspartate transcarbamylase

Résumé

L'aspartate transcarbamylase d'E. Coli, premier enzyme de la voie de biosynthèse des nucléotides pyrimidiques, constitue, en raison de sa complexité structurale et fonctionnelle, l'un des systèmes modèles les plus intéressants pour l'étude des phénomènes de régulation. La mise en évidence des modifications structurales dont cet enzyme est le siège lors des différents événements réactionnels, nécessite l'utilisation de techniques très variées tant chimiques que physiques. Dans un premier temps, après avoir précisé le nombre et la nature des sites nucléotidiques, nous montrons que les effecteurs n'agissent pas directe­ ment sur l'équilibre allostérique, mais par un effet ''primaire'' et un effet ''secondaire'' transmis par l'aspartate, et ceci par deux méthodologies différentes: l'étude biochimique d'une ATCase modifiée (2-ThioU-ATCase) l'étude des changements conformationnels régulateurs par diffusion des rayons X. Cette dernière méthode a permis de mettre en évidence deux aspects de la transition allostérique considérés jusqu'alors comme indissociables : la transition d'affinité et la transition structurale. La relation devant exister entre le mécanisme de fixation ordonné des substrats et la coopérativité, a été examinée en étudiant le comportement de l'enzyme vis-à-vis de pseudo-substrats utilisables dans la catalyse : l'alanosine, analogue de l'aspartate ; l'acétylphosphate et le N-méthyl-carbamylphosphate, analogues du carbamylphosphate. Afin d'obtenir des informations concernant la nature chimique des interactions entre sous-unités et leurs modifications lors des différents changements conformationnels régulateurs, nous avons réassocié des sous-unités catalytiques modifiées chimiquement avec des sous-unités régulatrices normales. Ceci nous a conduit à l’obtention d'une ATCase ne présentant plus les effets homotropes coopératifs entre les sites catalytiques. Un autre type d'étude, par perturbation de l'environnement de l'enzyme, à l'aide de co-solvants {en changeant la constante diélectrique du milieu), a permis d'obtenir des conditions où les formes extrêmes (T et R) de l'AT Case peuvent être stabilisées. Enfin, la fluorimétrie impulsionnelle en mode polarisé, a été utilisée pour suivre les changements conformationnels régulateurs de I'ATCase et mettre en évidence les mouvements de la matrice protéique.