Détermination de l'origine géographique des poissons par l'obtention de l'empreinte génétique de leur communauté bactérienne par PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Determination of geographical origin of fish by DNA fingerprinting of their bacterial community by PCR-DGGE technique (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

• Auteur / Autrice : Doan Duy Le Nguyen
• Direction : Didier Montet, Gérard Loiseau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie. Biotechnologie
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Montpellier 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Siluriformes

Pseudomonas

Provenance

Moronidae

Mots clés libres

Pcr-dgge

Origine géographique

Poisson-chat Pangasius

Pseudomonas

Bars

Traçabilité

Résumé

La détermination de l'origine géographique est une des exigences de la traçabilité des produits alimentaires. Notre hypothèse était que l'environnement de l'aliment pouvait avoir une influence sur la diversité des flores bactériennes commensales des poissons. L'origine géographique des poissons a donc été approchée par la caractérisation de la flore microbienne spécifique de la ferme de production ou du lieu de transformation et de stockage. Une technique de biologie moléculaire couplée à une analyse d'images et à des méthodes statistiques a été développée afin de relier les profils bactériens obtenus par PCR-DGGE à l'origine géographique des fermes aquacoles. Dans la première partie, nous avons différencié par DGGE des poissons d'espèces différentes qui venaient de sites différents: les bars de France, les poissons-chats Pangasius du Vietnam et du Cambodge. Les profils DGGE microbiens des poissons et de l'eau d'un même étang sont étroitement similaires, confirmant notre hypothèse de départ. Le séquençage des bandes issues de la DGGE a permis d'identifier les souches bactériennes dominantes des poissons-chats au Vietnam. Dans la deuxième partie, nous avons confirmé la pérennité des profils microbiens au cours de la saison des pluies et de la saison sèche au Vietnam. Les poissons péchés en mer ont un profil bactérien variable alors que la même espèce élevée en aquarium obtient un profil similaire pour tous les poissons. Les traitements de transformation tels que le séchage et le marinage ont une forte influence sur la communauté bactérienne des poissons. La congélation ou la réfrigération ne modifient pas fortement les profils DGGE. La persistance des marqueurs bactériens au cours des traitements technologiques a été vérifiée au niveau industriel dans une usine de transformation en filets des poissons-chats Pangasius qui sont les principaux produits exportés du Vietnam. L'écologie bactérienne des poissons a été suivie par PCR-DGGE à chaque étape de leur transformation montrant que le profil bactérien entre le produit initial et le produit fini est différent mais conserve suffisamment d'information pour discriminer l'origine. Dans la dernière partie, nous avons eu recours à la Rep-PCR pour étudier la diversité des souches de Pseudomonas qui ont montré une persistance aux procédures de transformation. Les Pseudomonas restent présents sur des filets finis ainsi que sur la surface des équipements après le nettoyage et la désinfection. 27 souches de Pseudomonas ont été classées dans 7 grandes groupes par rep-PCR et identifiées par séquençage

The determination of geographical origin is one of the inquiries of the food traceability system. Our hypothesis is that the environment could have an influence on the diversity of the bacterial communities of fish. The geographical origin of fish can be determined by the characterisation of the specific bacterial flora of the aquaculture farm or of the production and storage sites. A biological molecular technique PCR-DGGE, coupled to image analysis and statistic methods, have been developed in order to link the bacterial profiles with the geographical origin of the aquaculture farms. In the first chapter, we have distinguished by DDGE the different fish species from different sites: sea bass from France, Pangasius catfish from Vietnam and from Cambodia. The DGGE profiles of the fish bacteria and the water in the same pond were narrowly similar, confirming our hypothesis. The sequencing of the bands excised from DGGE gel permitted to identify the dominant bacterial species in the catfish from Vietnam. In the second chapter, we confirmed the perenniality of the microbial profiles during the rainy and the dry season in Vietnam. The fish captured in the sea had variable bacterial profiles, while the same fish raised in aquarium had a similar profile for all of them. Drying and pickling had a strong effect on the fish bacterial communities. Freezing or chilling did not change strongly the DGGE profiles. The persistence of the bacterial markers during the technical treatment has been verified at industrial scale in a factory processing Pangasius fillets, which is the principal exported product of Vietnam. The microbial ecology of the fish has been followed by PCR-DGGE for each processing step showing that the bacterial profiles of the initial product and the final product were different but preserved enough information to discriminate the origin. In the last chapter, Rep-PCR was used to study the diversity of Pseudomonas strains which showed persistence to the processing procedure. The Pseudomonas strains remained on the final fillets as well as on the equipment surfaces after cleaning and disinfection. 27 Pseudomonas strains classified in 7 big groups have been identified by sequencing