Expériences à haut débit et modélisation statistique des données pour l'ingénierie de la spécificité enzymatique

High-throughput experiments and statistical data modeling for the engineering of enzyme specificity

• Auteur / Autrice : Shoichi Yip
• Direction : Clément Nizak, Olivier Rivoire
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2025
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : Physique en Ile de France
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Jean Perrin
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Morphogénèse dans les systèmes moléculaires

Mots clés

Mots clés libres

Microfluidique

Machine learning

Enzyme

Physique statistique

Machine learning

Statistical physics

Enzyme

Microfluidics

Résumé

Nous proposons une nouvelle approche systématique pour l'ingénierie de la spécificité de substrat de la catalyse enzymatique, qui reste un problème ouvert sans solution générale, en utilisant les protéases S1A comme système-modèle. La biologie structurale a permis d'identifier des mutations qui sont souvent nécessaires mais pas suffisantes pour convertir la spécificité d'une enzyme. L'évolution in vitro a permis de résoudre ce problème dans certains cas, mais via une exploration inefficace de l'espace des séquences, due au manque de principe robustement établi pour choisir les résidus à muter et un point de départ favorable. Notre nouvelle approche générale commence par la mesure à haut débit de l'activité catalytique de milliers de protéases de la famille sur plusieurs substrats en combinant microfluidique en gouttelettes et séquençage ADN à haut débit. Ensuite nous extrairons des données les séquences de ‘protéases généralistes' ayant un profil de spécificité large qui serviront de points de départ favorables, et nous focaliserons les mutations au niveau des résidus déterminant la spécificité que nous aurons identifiés par analyse statistique des données. A partir des données nous inférerons également un modèle statistique génératif de la relation entre la séquence d'une protéase et son profil de spécificité, qui nous permettra de prédire le profil de protéases de la famille non-caractérisées, les mutations permettant de modifier le profil de spécificité de protéases connues, et in fine des séquences de protéases synthétiques de profils choisis au préalable. Au-delà du cadre académique, nos travaux ont des applications directes en séquençage peptidique et analyse par spectrométrie de masse, et offre un large potentiel applicatif en chimie verte, biotechnologie, et pour les industries agroalimentaire et pharmaceutique.

We propose a new, systematic approach to engineer the substrate specificity of enzymatic catalysis, a long-standing problem with no general solution, using S1A proteases as a model system. Structural biology has identified mutations that are often necessary but not sufficient to convert specificity. In vitro evolution has solved this problem in a few cases but at the cost of inefficient exploration of sequence space, for lack of a robust rationale to focus mutations and to choose favorable starting points. Our new general approach starts with measuring the catalytic activity of thousands of proteases across the enzyme family towards several substrates, in a cost/time-effective high throughput experiment combining droplet microfluidics and next generation DNA sequencing. Next, we will extract from the data sequences of ‘generalist' enzymes with broad specificity profiles as favorable starting points for the in vitro evolution of specificity, and focus mutations at specificity-determining residues we have identified via statistical data analysis. From the data we will also infer a generative statistical model of the relation between enzyme sequence and specificity profile, which will predict the specificity of uncharacterized proteases, mutations in known proteases to engineer their specificity, and ultimately sequences of synthetic proteases with tailored specificity profiles. Beyond solving a fundamental problem, our work has direct applications in peptide sequencing and mass spectrometry analysis, and its potential applications extend to green chemistry, biotechnology, the agro- and the pharmaceutical industry.