Caractérisation structurale et fonctionnelle du domaine composite ‘ajout de coiffe / assemblage membranaire' de la polyprotéine de réplication du virus de l'hépatite E

Structural and functional studies of the composite domain ‘capping / membrane assembly' of the replication polyprotein of hepatitis E virus

• Auteur / Autrice : Gabriel Vanegas arias
• Direction : Sonia Fieulaine, Stéphane Bressanelli
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Inscription en doctorat le 01/06/2025
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de pharmacie

Mots clés

Mots clés libres

Biochimie des membranes

Simulations

Virus à ARN simple brin de polarité positive

Biologie structurale (cryo-microscopie électronique

Virus de l'hépatite E

Membrane biochemistry

Simulations

Single-stranded positive-sense RNA viruses

Structural biology (cryo-electron microscopy

Hepatitis E virus

Résumé

Les virus à ARN positif répliquent leur génome d'ARN simple brin de polarité positive au sein de structures intracellulaires construites à partir d'endomembranes de la cellule infectée. Deux types de déformations de membranes ont été décrits, correspondant à des sphérules ou à des vésicules à double membrane. Si la caractérisation des complexes de réplication associés aux vésicules n'a que peu évolué, des progrès spectaculaires ont été réalisés ces sept dernières années pour les complexes de réplication associés aux sphérules, notamment grâce à la démocratisation de la cryo-microscopie électronique. Il a été montré, chez le virus du Chikungunya (CHIKV) et le Flock house virus (FHV)), que le complexe de réplication se situe à l'entrée de la sphérule membranaire viro-induite. Il est constitué a minima d'un oligomère annulaire contenant 12 sous-unités d'une protéine virale dont la fonction enzymatique est l'ajout de coiffe sur les molécules d'ARN viral nouvellement synthétisés. Dans le cas de ces deux virus, cette protéine à double fonction (ajout de coiffe / association aux membranes) apparaît alors comme le facteur clé de la formation du complexe de réplication. Dans le cadre de nos travaux sur la polyprotéine de réplication ORF1 du virus de l'hépatite E (HEV), nous avons montré que son domaine N-terminal appelé MetY est non seulement une méthyltransférase qui participe à l'acquisition de la coiffe des ARNs viraux pour leur traduction, mais aussi certainement un moteur de la formation du complexe de réplication. Comme pour les protéines homologues du CHIKV et du FHV, ce domaine MetY s'oligomériserait en interagissant avec les membranes intracellulaires de la cellule hôte. Nos résultats préliminaires corroborent cette hypothèse et nous souhaitons durant cette thèse décrire précisément les fonctions du domaine MetY (oligomérisation, association aux membranes, activité enzymatique) au cours du cycle de réplication virale et notamment au cours de la formation du complexe de réplication. Nous étudierons le domaine MetY seul pour commencer, puis élargirons nos études au module N-terminale de la polyprotéine, puis à la polyprotéine entière, de façon à se rapprocher au plus près de la fonction de MetY dans un contexte biologique. Notre approche globale combinera des techniques très complémentaires de biochimie, de biophysique et de biologie structurale, expérimentales et bio-informatiques.

Single-stranded, positive-sense RNA ((+)RNA) viruses replicate their RNA genome in a replication complex hosted in a virus-induced compartment built from remodeled host endomembranes, providing a safe environment to replicate the viral genome prior to encapsidation in new viral particles. Two morphotypes of membrane deformation have been described, corresponding to spherules or double membrane vesicles. While characterization of replication complexes associated with vesicles has not evolved much, spectacular progress has been made over the last five years for replication complexes associated with spherules, notably thanks to the democratization of cryo-electron microscopy. For Chikungunya virus (CHIKV) and Flock house virus (FHV), it has been shown that the replication complex is located at the entrance to the virus-induced membrane spherule. It comprises at least one oligomeric ring containing 12 subunits of a viral protein whose enzymatic function is to add caps to newly synthesized viral RNA molecules. In the case of these two (+)RNA viruses, this dual-function protein (cap addition / membrane association) appears to be the key factor in the formation of the replication complex. During our work on the hepatitis E virus (HEV) replication polyprotein ORF1, we have shown that its N-terminal domain called MetY is not only a methyltransferase involved in viral RNA cap acquisition, but also a driver of replication complex formation. Similarly to homologous CHIKV and FHV proteins, this MetY domain would oligomerize when interacting with host cell intracellular membranes. Our preliminary results corroborate this hypothesis, and we now wish to describe in details the functions of the MetY domain (oligomerization, membrane association, enzymatic activity) during the viral replication cycle, and in particular during the formation of the replication complex. We will start by studying the MetY domain alone, then extend our studies to the N-terminal module of the polyprotein, and then to the whole polyprotein, in order to get as close as possible to the function of MetY in a biological context. Our overall approach will combine highly complementary biochemical, biophysical and structural biology, experimental and bioinformatics techniques.