Rôle de l'ARN flaviviral subgénomique contenu dans les vésicules extracellulaires du moustique dans la transmission virale

Role of subgenomic flaviviral RNA contained in mosquito extracellular vesicles in viral transmission

• Auteur / Autrice : Idalba Serrato-pomar
• Direction : Oleg Mediannikov, Julien Pompon
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Maladies Infectieuses
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 09/02/2024
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CRCM - Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : CRCM - Vésicules extracellulaires : mécanismes de signalisation et ingénierie thérapeutique
• Jury : Président / Présidente : Christophe Paupy
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Oleg Mediannikov, Mathilde Gendrin, Karim Majzoub, Sarah Merkling, Pierre-Yves Lozach, Dorothee Misse, Julien Pompon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mathilde Gendrin, Sarah Merkling

Mots clés

Mots clés libres

Flavivirus

Vésicules extracellulaires

Moustique

SfRNA

Virus du Nil Occidental

Virus Zika

Mosquito

Flavivirus

Extracellular vesicles

SfRNA

West Nile Virus

Zika virus

Résumé

Les flavivirus transmis par les moustiques sont responsables d'environ 500 millions d'infections dans le monde par an. Alors que les infections par le virus du Nil occidental (VNO) et le virus Zika (ZIKV) sont endémiques dans les pays tropicaux et subtropicaux, ils sont apparus dans des régions tempérées telles que l'Europe et l'Amérique du Nord au cours de la dernière décennie. Malheureusement, il n'existe aucun traitement spécifique ou vaccin contre ces virus. Les stratégies de contrôle se limitent aux interventions sur les vecteurs, qui ont peu d'efficacité et qu’il est difficile de maintenir dans le temps. Contribuer à la connaissance des déterminants moléculaires de la transmission virale est important pour le développement de nouvelles méthodologies de contrôle. Bien que tous les flavivirus produisent de l'ARN sous-génomique (ARNsf) avec des fonctions anti-immunitaires chez les moustiques et les humains, il reste à déterminer si la sécrétion salivaire d'ARNsf pour augmenter la transmission est un mécanisme conservé parmi les flavivirus. J’ai infecté les moustiques Culex quinquefasciatus avec le VNO par alimentation orale pour tester cette hypothèse. J’ai détecté l'ARNsf dans 100 % de la salive avec une moyenne géométrique (MG) de 4,15 x 105 copies par échantillon infecté. J’ai également infecté des moustiques par inoculation intrathoracique et ai constaté que l’infection du tube digestif n'est pas nécessaire pour la sécrétion d'ARNsf dans la salive. J’ai trouvé de l'ARNsf dans 80 % de la salive infectée (MG, 2,09 x 105 copies). Pour évaluer si davantage d'espèces de flavivirus sécrètent de l'ARNsf dans la salive de différentes espèces de moustiques, nous avons infecté Aedes aegypti avec le ZIKV par inoculation intrathoracique et détecté l'ARNsf de ZIKV dans 100 % de la salive (MG, 2,47 x 105 copies). Des vésicules lipidiques capables de transférer leur cargaison aux cellules humaines pourraient protéger l'ARNsf salivaire et servir de mode de sécretion. Pour tester si l'ARNsf du VNO et du ZIKV étaient contenus dans des vésicules extracellulaires, j’ai quantifié la résistance de l'ARNsf à la dégradation par les RNases avec ou sans perméabilisation par le Triton des membranes lipidiques. Après avoir vérifié que les RNases dégradent l'ARNsf transcrit in vitro, j’ai rapporté qu'une partie de l'ARNsf était protégée de la dégradation par une membrane sensible au Triton. Pour connaître le rôle de l'ARNsf salivaire dans la transmission, j’ai utilisé des pools de salive de moustiques Cx. quinquefasciatus infectés par voie orale avec le VNO. Nous avons quantifié l'ARNsf et classé les pools de salive en catégories de concentrations de sfRNA faibles, modérées ou élevées. Ensuite, j’ai infecté des cellules humaines avec chaque catégorie et quantifié le VNO à 24 et 48 heures post-infection (hpi). L'augmentation progressive de l'infectivité de la salive en fonction de la concentration d'ARNsf a soutenu l'hypothèse selon laquelle l'ARNsf salivaire augmente l'infectivité de la salive. J’ai évalué l'effet de l'ARNsf salivaire du VNO sur la réponse immunitaire antivirale en quantifiant les transcrits cellulaires codant pour l'IFN-β et les gènes induits par l'IFN dans les mêmes échantillons. L’inhibition de la réponse IFN initiale suggère que l’ARNsf salivaire augmente l’infection en mitigeant la réponse immunitaire. J’ai également infecté des cellules déficientes en RIG-I avec la même salive et constaté que la fonction de l'ARNsf du VNO pour augmenter l'infection est indépendante de la voie RIG-I. Dans l’ensemble, mon étude identifie un nouvel activateur de transmission pan-flaviviral qui est propice à la conception de nouvelles stratégies d’intervention.

Mosquito-borne flaviviruses are responsible for around 500 million infections worldwide annually. While West Nile Virus (WNV) and Zika virus (ZIKV) infections are endemic in tropical and subtropical countries, they have emerged in temperate regions such as Europe and North America over the past decade. Unfortunately, there is no specific treatment or vaccine against these viruses. Control strategies are restricted to vector interventions, which have limited efficacy and are difficult to sustain over time. Contributing to the knowledge of the molecular determinants of viral transmission is important for the development of new control interventions. Although all flaviviruses produce subgenomic flaviviral RNA (sfRNA) with anti-immune functions in mosquitoes and humans, it remains to be determined whether salivary secretion of sfRNA to enhance transmission is also a conserved mechanism among flaviviruses. I infected Culex quinquefasciatus mosquitoes with WNV through oral feeding to test this hypothesis. SfRNA was detected in 100% of saliva with a geometric mean (GM) of 4.15 x 105 copies per infected sample. I then infected mosquitoes by intrathoracic inoculation and found that the midgut is not required for sfRNA secretion into saliva. To evaluate whether multiple flavivirus species secrete sfRNA in saliva of different mosquito species, I infected Aedes aegypti with ZIKV by intrathoracic inoculation and detected ZIKV sfRNA in 100% of the saliva (GM, 2.47 x 105 copies). Lipid vesicles that can transfer their cargo to human cells could be used as a secretion mechanism for salivary sfRNA. To test whether WNV and ZIKV sfRNA were contained within extracellular vesicles, I quantified the resistance of sfRNA to degradation by RNases with or without Triton permeabilization of lipid membranes. After verifying that RNases degrade synthetic sfRNA, I reported that part of sfRNA was protected from degradation by a Triton-sensitive membrane. To determine the role of salivary sfRNA in transmission, I used saliva pools from Cx. quinquefasciatus mosquitoes orally infected with WNV. I quantified sfRNA and classified saliva pools into categories of low, moderate, and high sfRNA concentrations. Then, I infected human cells with each saliva category and subsequently quantified WNV at 24 and 48 hours post-infection (hpi). The progressive increase in saliva infectivity following the category of sfRNA supported the hypothesis that salivary sfRNA enhances saliva infectivity. I evaluated the effect of salivary WNV sfRNA on antiviral immune response by quantifying cellular transcripts encoding IFN-β and IFN-stimulated genes in the same samples. Inhibition of early IFN response suggested that salivary sfRNA enhances infection by modulating immune response. I then infected RIG-I deficient cells with the same salivas and found that the pro-viral function of WNV sfRNA was independent of RIG-I pathway. Altogether, my study identifies a new pan-flaviviral transmission enhancer that is amenable to designing novel intervention strategies.