Développement d’un format d’anticorps bispécifique innovant pour l’élimination ciblée de la cytokine pro tumorale TGFβ dans le cancer colorectal.

Development of an innovative bispecific antibody format for the targeted elimination of the pro-tumor cytokine TGFβ in colorectal cancer.

• Auteur / Autrice : Ikrame Dadi
• Direction : Marie-Alix Poul
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 28/11/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IRCM - Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Céline Gongora
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Alix Poul, Marielle Valerio-lepiniec, Patrick Chames, Frédéric Jean-alphonse
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marielle Valerio-lepiniec, Patrick Chames

Mots clés

Mots clés libres

Immunothérapie

Ingénierie des anticorps

Cancer colorectal

Immunotherapy

Antibody engineering

Colorectal cancer

Résumé

Le cancer colorectal (CCR) est une maladie dont la morbidité et la mortalité fait partie des plus élevées au niveau mondial. Au moment du diagnostic, environ 20% des patients atteints d’un CCR présentent des métastases hépatiques, et au cours de la maladie, plus de la moitié d’entre eux en développeront. Malgré les progrès thérapeutiques, la majorité des patients atteints d’un CCR métastatique restent incurables. Il a été démontré qu’un taux élevé de TGFβ circulant est prédicteur de métastases hépatiques après résection du CCR et associé à un mauvais pronostic. Le TGFβ est impliqué dans la tumorigénèse où il joue un rôle ambivalent puisqu’il a une action antitumorale dans les stades précoces et protumorale dans les stades avancés, avec un rôle dans les métastases et l’inhibition des réponses immunitaires antitumorales. De nombreux médicaments ciblant la signalisation TGFβ sont actuellement testés, dont des anticorps anti-TGFβ, et bien que le ciblage montre des effets prometteurs, notamment en association à l’immunothérapie il donne lieu à des effets secondaires attribués à la neutralisation systémique de la signalisation TGFβ. Dans ce contexte, nous avons développé une nouvelle classe d’anticorps bispécifiques (bsAb) avec une activité de balayage visant à éliminer de manière ciblée et continue le TGFβ dans le microenvironnement tumoral. Le mode d’action des anticorps utilisés en clinique pour inhiber l’action de facteurs solubles (FS) et notamment le TGFβ est généralement fondée sur la liaison d’un épitope neutralisant et la formation d’un complexe immun qui conduit à l’accumulation du FS dans l’organisme, à cause de la faible clairance du complexe immun comparée à celle du FS libre. A l’arrêt du traitement, on observe un effet rebond, avec libération du FS qui peut entrainer la reprise de la maladie. Par ailleurs, la neutralisation systémique causée par l’anticorps peut provoquer des effets secondaires limitant l’utilisation du médicament comme observé pour le TGFβ. La conception du bsAb repose sur (1) une liaison pH-indépendante au récepteur à la transferrine 1 (TfR1) qui est surexprimé dans les CCR et permet d’internaliser puis de recycler le complexe TfR1-BsAb et (2) la liaison simultanée de manière pH-dépendante au TGFβ provoquant une libération de ce dernier dans l'endosome dû à une baisse de pH, puis à sa dégradation dans les lysosomes. Pour réaliser ce BsAb, 3 formats ont été initialement produits et évalués : scFv-kiH, IgG-(HC)-scFv et IgG-(LC)-scFv. Sur la base d’analyses de dévelopabilité (production et stabilité), d’affinité de liaison pour les antigènes, de fonctionnalité in vitro et d’accumulation tumorale in vivo, nous avons sélectionné le format IgG-(HC)-scFv comme format optimal. Le développement de la pH-dépendance du bras anti-TGFβ a impliqué la modification du paratope de l’anticorps neutralisant fresolimumab, via la substitution en histidine d’1 à 9 acides aminés identifiés par une analyse structurale dans le but de conserver une liaison forte au TGFβ à pH physiologique et une dissociation rapide à pH acide. La méthode de yeast-display couplée au séquençage de nouvelle génération a permis de sélectionner les variants présentant les propriétés recherchées, parmi lesquelles un variant a démontré les caractéristiques requises. Les études fonctionnelles in vitro ont montré que le BsAb développé est capable d’éliminer activement le TGFβ extracellulaire dans un modèle cellulaire de CCR (lignée humaine HT29). Par ailleurs, l’étude sur des souris nude greffées avec des cellules HT29 a révélé une accumulation du BsAb dans les tumeurs par rapport à l’anticorps fresolimumab au format classique IgG. L’étape suivante est le test de l’efficacité du bsAb dans un modèle préclinique de CRC pour évaluer pleinement son potentiel thérapeutique. Cette approche ouvre des perspectives prometteuses pour l'élimination ciblée du TGFβ dans le cancer ou d'autres pathologies où elle joue un rôle clé dans la progression de la maladie.

Colorectal cancer (CRC) is a disease with one of the highest morbidity and mortality rates in the world. At diagnosis, around 20% of CRC patients develop liver metastases, and over the course of the disease, more than half will go on to do so. Despite therapeutic advances, most patients with metastatic CRC remain incurable. A high level of circulating TGFβ has been shown to be predictive of liver metastases after CRC resection and associated with a poor prognosis. TGFβ is involved in tumorigenesis, where it plays an ambivalent role, being antitumoral in the early stages and protumoral in the advanced stages, with a role in metastasis and inhibition of antitumoral immune responses. Numerous drugs targeting TGFβ signaling are currently being tested, including anti-TGFβ antibodies, and although targeting shows promising effects, particularly in combination with immunotherapy it gives rise to side effects attributed to the systemic neutralization of TGFβ signaling. In this context, we have developed a new class of bispecific antibodies (bsAb) with sweeping activity aimed at targeted and continuous removal of TGFβ from the tumor microenvironment. The classic mode of action of antibodies used clinically to inhibit the action of soluble factors (SFs), and TGFβ in particular, is generally based on the binding of a neutralizing epitope and the formation of an immune complex that leads to the accumulation of SFs in the body, due to the low clearance of the immune complex compared to that of free SFs. When treatment is discontinued, a rebound effect is observed, with release of SF, which may lead to a relapse. In addition, systemic neutralization by the antibody can cause side effects that limit the use of the drug, as observed with TGFβ. The design of bsAb is based on (1) pH-independent binding to transferrin receptor 1 (TfR1), which is overexpressed in CRCs and internalizes and then recycles the TfR1-BsAb complex, and (2) simultaneous pH-dependent binding to TGFβ, resulting in its release into the endosome due to a drop in pH, followed by degradation in lysosomes. To realize this BsAb, three formats were initially produced and evaluated: scFv-kiH, IgG-(HC)-scFv and IgG-(LC)-scFv. Based on analyses of developability (production and stability), antigen-binding affinity, in vitro functionality and in vivo tumor accumulation, we selected IgG-(HC)-scFv as the optimal format. Developing the pH-dependence of the anti-TGFβ arm involved modifying the paratope of the neutralizing antibody fresolimumab, via the histidine substitution of 1 to 9 amino acids identified by structural analysis with the aim of retaining strong binding to TGFβ at physiological pH and rapid dissociation at acidic pH. The yeast surface display method coupled with next generation sequencing enabled selection of variants with the desired properties, among which one variant demonstrated the required characteristics. In vitro functional studies showed that the BsAb developed is capable of actively eliminating extracellular TGFβ in a CRC cell model (human HT29 line). In addition, the study on nude mice grafted with HT29 cells revealed an accumulation of BsAb in tumors compared with the fresolimumab antibody in conventional IgG format. The next step is to test the efficacy of bsAb in a preclinical model of CRC to fully evaluate its therapeutic potential. This approach opens promising prospects for the targeted elimination of TGFβ in cancer or other pathologies where it plays a key role in disease progression.