Modélisation pathologique de dystrophies musculaires sans diagnostic avec les cellules souches pluripotentes induites de patients.

Modeling undiagnosed muscular dystrophies using patients' stem cells.

• Auteur / Autrice : Imane Ben daoud
• Direction : Leslie Caron
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Génétique
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2024
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : MMG - Marseille Medical Genetics
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : MMG - Dynamique épigénétique et du nucléosquelette dans les maladies rares

Mots clés

Mots clés libres

Dystrophie Musculaire

Cellules Souches

Crispr

Modélisation Pathologique

Edition du génome

Muscular Dystrophy

Stem Cells

Crispr

Pathological Modeling

Genome Editing

Résumé

Les dystrophies musculaires (DM) entrainent une atteinte progressive du muscle squelettique aboutissant à une perte des fibres musculaires et une hypotonie. Les DM sont nombreuses et diverses. Plus de 100 gènes impliqués dans les DM ont déjà été identifiés. De nombreux gènes restent cependant à découvrir et plusieurs milliers de patients atteints de DM sont actuellement sans diagnostic précis en France. En combinant génomique et modélisation à partir de cellules souches pluripotentes induites dérivées de patients (hiPSC - human induced Pluripotent Stem cells), nous proposons d'identifier les mutations et les mécanismes moléculaires régissant des pathologies musculaires jusque-là non diagnostiquées dans le but de faciliter leur classification. Des hiPSC ont déjà été dérivées pour 2 patients atteints de DM non-diagnostiquées. Nous disposons déjà d'une large collection de cellules contrôles appariées en âge et sexe pour les patients. Nous proposons de différencier les hiPSC dérivées de patients atteints de DM non-diagnostiquées en cellules musculaires squelettiques (SkMCs) et de conduire une caractérisation phénotypique et fonctionnelle approfondie de ces cellules. Nous réaliserons également une analyse transcriptomique des SkMCS dérivées des hiPSC de patients DM non-diagnostiquées que nous comparerons avec les SkMCs dérivées de cellules contrôles de sujets sains et de sujets atteints de DM connues dont les lignées hiPSC sont disponibles au laboratoire (DMD, DM1, LAMA2-DR, FSHD, SMA, Sarcoglyconopathies). Nous pourrons ainsi dégager différentes catégories de gènes dont l'expression est modulée dans la pathologie et séparer les différentes pathologies en sous-groupes précis en fonction des voies biologiques altérées. Ceci permettra de classifier chaque DM non-diagnostiquée dans une «catégorie probable» de DM. Nos données ouvriront de nouvelles pistes pour la classification de ces maladies et permettront de réduire l'errance ou l'impasse diagnostique pour ces patients. Cette classification unique et originale permettra également de mettre en évidence les mécanismes moléculaires survenant lors de ces processus pathologiques et pourra aboutir à l'identification de cibles thérapeutiques potentielles. L'analyse approfondie des séquences génomiques du premier patient sélectionné a permis d'identifier un variant homozygote de signification inconnue sur le gène de la Plectine (PLEC1). La Plectine est un des filaments intermédiaires essentiels au maintien de l'architecture de la cellule. Son déficit peut entrainer des pathologies cutanées ou neuromusculaires variées (myopathie myofibrillaire, dystrophie musculaire, syndrome myasthénique congénital). Cette mutation homozygote identifiée pourrait donc être responsable de la DM du patient 1. Cette hypothèse sera explorée. La pathogénicité de ce variant sera notamment confirmée par la création de lignées corrigées CRISPR/Cas9 qui pourront permettre de préciser l'impact de la mutation sur le phénotype à l'échelle cellulaire et valider nos données RNAseq et fonctionnelles. Les analyses du séquençage du patient 2 sont toujours en cours et seront validés en suivant la même méthodologie si des mutations susceptibles d'entrainer une DM sont identifiés. Notre étude représentera une preuve de concept pour la classification des pathologies musculaires non labellisées et fournira à terme des pistes innovantes pour le diagnostic et le traitement de ces maladies invalidantes.

Muscular dystrophy (MD) is a progressive impairment of the skeletal muscle, resulting from the mutation of one or more genes controlling muscle functions and structures. In these pathologies, the skeletal muscle is the site of degeneration leading to a loss of muscle fibers and therefore to hypotonia. DMs are numerous and diverse. To date, more than 100 genes involved in DM have been identified. However, many genes remain to be discovered and several thousand patients suffering from DM are currently without a precise diagnosis in France. By combining genomics and modeling from patient-derived stem cells (hiPSC - human induced Pluripotent Stem Cells), we propose to identify mutations and molecular mechanisms governing previously undiagnosed muscle pathologies with the aim of facilitating their classification. HiPSC have already been derived for 2 patients affected with undiagnosed muscular dystrophies. Control lines, matched in age and sex, are also available in the laboratory. We propose to differentiate patients' hIPSC into skeletal musle cells (SkMCs) and to conduct an in-depth phenotypic and functional characterization of these cells. We will also carry out a transcriptomic analysis of undiagnosed DM patients hiPSC-SkMCS which we will compare with SkMCs derived from control lines from healthy subjects and subjects with known DM whose hiPSC lines are available in the laboratory (DMD, DM1, LAMA2-DR, FSHD, SMA, Sarcoglyconopathies). We will therefore be able to identify different categories of genes modulated by the pathology and to separate the different pathologies into precise subgroups according to the altered biological pathways, which will allow the classification of each UMD in a “probable category” of MD. Our data will open new avenues for the classification of these MDs, reducing the risk of misdiagnosis or lack of diagnosis for these patients. This unique and original classification will also highlight the molecular mechanisms occurring during these pathological processes and could lead to the identification of potential therapeutic targets. In-depth analysis of the genomic sequences of the first selected patient identified a homozygous variant of unknown significance in the Plectin gene (PLEC1). Plectin, one of the intermediate filaments, is essential for maintaining the architecture of the cell. Its deficiency can lead to various cutaneous or neuromuscular pathologies (myofibrillar myopathy, muscular dystrophy, congenital myasthenic syndrome). This identified homozygous mutation could therefore be responsible for the MD of patient 1. This hypothesis will be explored. The pathogenicity of this variant will be confirmed in particular by the creation of corrected CRISPR/Cas9 lines which will be used to clarify the impact of the mutation at the cellular level and validate our RNAseq and functional data. The sequencing analyses of patient 2 are still in progress and will be validated following the same methodology if mutations likely to cause MD are identified. Our study will represent a proof of concept for the classification of unlabeled muscle pathologies and, in the long term, will provide innovative leads for the diagnosis and the treatment of these debilitating diseases.