Mécanismes de développement des muscles chez la méduse Pelagia noctiluca

Muscle developmental mechanisms in the jellyfish Pelagia noctiluca

• Auteur / Autrice : Clara Deleau
• Direction : Lucas Leclere
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/12/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie intégrative des organismes marins
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Régénération, développement et évolution des cnidaires

Mots clés

Mots clés libres

Dynamique des myofibrilles

Muscle strié

Système neuro-musculaire

Régulation transcriptionnelle

Évolution et développement

Striated Muscle

Neuro-muscular system

Myofibril Dynamics

Transcriptional Regulation

Evolution and Development

Résumé

Les muscles striés sont des tissus contractiles qui permettent des mouvements et des comportements complexes. Ils s'organisent en unités moléculaires répétées appelées sarcomères et sont présent à la fois chez les animaux bilatériens et chez les méduses cnidaires. Une étude historique a proposé qu'ils aient évolué indépendamment (Steinmetz et al., 2012, Leclère et Rottinger 2017). Cette hypothèse était soutenue par l'absence de gènes clés de protéines du sarcomère des bilatériens dans les génomes de méduses (titine et troponine) et par le fait que les protéines LBD3/Zasp, muscle LIM et α-actinine exclusivement sarcomériques chez les bilatériens sont également exprimées dans les cellules non musculaires chez les méduses. Cependant, nos récents travaux sur la localisation des homologues des protéines sarcomériques des bilatériens chez les méduses remettent en question cette hypothèse. L'origine évolutive des muscles striés chez les animaux reste une question ouverte. Nous utilisons la méduse scyphozoaire Pelagia noctiluca comme nouvel organisme modèle. Sa combinaison unique de caractéristiques en fait un modèle idéal pour étudier le développement des muscles striés. Dans le cycle de vie simplifié de Pelagia, les méduses juvéniles (ephyrae) se développent directement à partir d'œufs fécondés en 5 jours et les cellules musculaires striées se développant entre le deuxième et le quatrième jour de développement. Cela contraste fortement avec la plupart des autres espèces de cnidaires, qui produisent des méduses de manière asexuée à partir de polypes, souvent des années après la fécondation. Le cycle de vie complet de Pelagia est maîtrisé dans le laboratoire de l'OOB (Observatoire Océanologique de Banyuls-sur-Mer) et la ponte peut être déclenchée de manière fiable par un stress lumineux. Les œufs peuvent être injectés et tous les stades de développement peuvent être imagés et manipulés. Nous avons déjà produit un génomes à l'échelle chromosomique pour Pelagia noctiluca ainsi qu'un atlas de données transcriptomiques en cellules uniques sur 6 stades de développement. Nous avons également établi un large éventail de protocoles (immunofluorescence, hybridation in situ, TEM, SEM, analyses fonctionnelles). Pelagia est maintenant l'organisme modèle idéal pour tester la conservation évolutive de l'organisation et du développement des muscles de la méduse. Ce projet de doctorat vise à découvrir les principales étapes du développement des muscles striés chez Pelagia noctiluca, afin de mieux comprendre l'évolution des systèmes musculaires. Le projet est divisé en deux parties complémentaires : 1) Découvrir le réseau transcriptionnel conduisant à la détermination des cellules musculaires striées de Pelagia. L'exploitation de notre atlas de cellules uniques des stades de développement de Pelagia (~80k cellules à 6 stades de développement, de la gastrula au juvénile) permettra d'identifier l'ensemble des facteurs de transcription caractéristiques des précurseurs des muscles striés aux différents stades. Le profil d'expression des facteurs de transcription sera analysé par hybridation in situ et couplé à d'autres techniques de marquage, notamment pour la prolifération cellulaire (incorporation d'EdU). Le rôle respectif des TFs myogéniques putatifs sera étudié par des expériences de knockdown et de sauvetage par morpholino, CRISPR/Cas9-gRNA et injection d'ARNm dans des œufs fécondés de Pelagia. Les phénotypes knockdown seront évalués par hybridation in situ et immunofluorescence aux stades sélectionnés. En fonction des résultats, différentes combinaisons de knockdown seront réalisées pour déterminer les potentielles interactions entre les régulateurs transcriptionnels identifiés. 2) Décrire les étapes menant à la fonctionnalisation du système musculaire chez Pelagia. La morphologie des cellules musculaires striées, la dynamique des myofibrilles et la connexion aux cellules voisines et aux neurones seront analysées par immunomarquage (en utilisant des anticorps commerciaux et personnalisés), par microscopie électronique en volume (MEV) et par des approches d'imagerie en direct entre le deuxième et le cinquième jour (fin) du développement de l'ephyra. Un accent particulier sera mis sur la caractérisation de la dynamique de l'élongation des myonèmes et des jonctions neuro-musculaires. En conjonction avec nos travaux en cours sur la description de la dynamique du développement des sarcomères chez Pelagia, ce projet devrait fournir des preuves solides pour établir l'origine des muscles striés chez les animaux.

Striated muscles are contractile tissues that allow complex movements and behaviors. They are organized into repeated molecular units, called sarcomeres. They are found both in bilaterian animals and cnidarian jellyfish and a landmark study proposed that they evolved independently (Steinmetz et al., 2012, Leclère and Rottinger 2017). This hypothesis was supported by the absence of key bilaterian sarcomere protein genes in jellyfish genomes (titin and troponin) and by the fact that LBD3/Zasp, muscle LIM protein and α-actinin are also expressed in non-muscle cells, as revealed by in situ hybridization. However, our recent work addressing the localization of homologs of bilaterian sarcomeric proteins in jellyfish, based on custom antibodies, challenges this hypothesis. The evolutionary origin of striated muscles in animals remains an open question. We are using the scyphozoan medusa Pelagia noctiluca as a new model organism. Its unique combination of features makes it an ideal model to study striated muscle development. In the simplified Pelagia life cycle, juvenile medusae (ephyrae) develop directly from fertilized eggs in 5 days, with striated muscle cells developing between the second and fourth day of development. This is in sharp contrast to most other cnidarian species, which produce medusae asexually from polyps often years post-fertilization. The complete life cycle of Pelagia is mastered in the lab at the OOB (Observatoire Océanologique de Banyuls-sur-Mer) and spawning can be reliably triggered by a dark-light transition. Eggs can be injected and all developmental stages can be imaged and manipulated. We already generated a chromosome level genome assembly for Pelagia noctiluca as well as a single cell atlas of development. We also established a wide range of protocols (immunofluorescence, in situ hybridization, TEM, SEM, functional assays). Pelagia is now the ideal model organism to test the evolutionary conservation of the organization and development of the medusa muscles. This PhD project aims at uncovering the main developmental steps leading to the development of striated muscles in Pelagia noctiluca, to provide insights into the evolution of muscular systems. The project is divided in two complementary parts: 1) Uncovering the transcriptional network leading to the determination of Pelagia striated muscle cells. Mining of our existing single cell atlas of Pelagia developmental stages (~80k cells at 6 stages of development from gastrula to juvenile) will allow identifying the set of transcription factors characteristics of striated muscle precursors at the different stages. Expression pattern of the TFs will be analyzed by in situ hybridization and coupled with other labelling techniques, notably for cell proliferation (EdU incorporation). The respective role of the putative myogenic TFs will be investigated by knockdown and rescue experiments through morpholino, CRISPR/Cas9-gRNA and mRNA injection in Pelagia fertilized eggs. Knockdown phenotypes will be assessed by in situ hybridization and immunofluorescence at selected stages. Depending on the results, different knockdown combinations will be performed to determine the interaction between the identified transcriptional regulators. 2) Describing the steps leading to the functionalization of the muscular system in Pelagia. Striated muscle cell morphology, myofibril dynamics and connection to neighboring cells and neurons will be analyzed by immunostaining (using commercial and custom made antibodies), volume electron microscopy (vEM) and live imaging approaches between the second and the fifth day (end) of ephyra development. A particular emphasis will be put on characterizing the dynamics of myoneme elongation and neuro-muscular junctions. In conjunction with our ongoing work on describing the dynamics of sarcomere development in Pelagia, this project should provide solid evidence to settling the origin of striated muscles in animals.