Caractérisation fonctionnelle des sites de glycosylation en amont des sites de clivage de la protéine spike de SARS-CoV-2

Functional characterization of glycosylation sites upstream of the cleavage sites of the SARS-CoV-2 spike protein

• Auteur / Autrice : Emma Louvet
• Direction : Muriel Lavie
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé - MED
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2024
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'Infection et d'Immunité de Lille
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Virologie Moléculaire et Cellulaire

Mots clés

Mots clés libres

Glycoprotéines virales

Entrée virale

Fusion membranaire

SARS-CoV-2

Coronavirus

Membrane fusion

SARS-CoV-2

Coronavirus

Viral glycoprotein

Viral entry

Résumé

Depuis fin 2019, le nouveau coronavirus humain SARS-CoV-2 a infecté plus de 764 millions de personnes dans le monde, causant plus de 7 millions de décès. Parmi les protéines structurales de la particule, la glycoprotéine de spike S qui est ancrée dans l'enveloppe virale est le principal déterminant de l'entrée virale et la principale cible des anticorps neutralisants. Ainsi, elle constitue une cible stratégique majeure pour le développement de thérapies antivirales. Elle est composée des sous-unités S1 et S2 qui sont respectivement impliquées dans l'interaction avec le récepteur ACE2 et la fusion entre l'enveloppe virale et la membrane cellulaire. L'induction de la fusion nécessite un clivage à la jonction entre S1 et S2 ainsi qu'au site S2' situé en amont du peptide de fusion. De manière intéressante, SARS-CoV-2 S présente une insertion de 4 résidus à la jonction S1/S2 qui sont absents chez les coronavirus les plus proches et qui constituent un motif polybasique reconnu par les protéases de type furine. De plus, S est densément glycosylée puisqu'elle compte 22 sites de N-glycosylation. Plusieurs sites sont localisés à proximité des sites de clivage S1/S2 et S2'. Des données préliminaires suggèrent que les sites localisés en amont de S2' (N709, N717, N801) sont nécessaires à la maturation et à l'expression en surface de S tandis que les sites en amont de S1/S2 (N603, N616, N657) semblent masquer un site de clivage additionnel localisé au niveau du résidu R634. En effet, la mutation de ces sites conduit à la détection d'une sous unité S1 de plus faible poids moléculaire. De plus, la mutation de R634 abolit le clivage du mutant S N603Q, N616Q, N657Q sans impacter celui de S sauvage. Dans ce contexte, nous proposons de caractériser le clivage alternatif de S observé en l'absence des sites de glycosylation N603, N616, N657. Pour cela, nous déterminerons la séquence de la sous unité S1 alternative, chercherons à identifier les résidus nécessaires au clivage ainsi que la protéase impliquée. Enfin, nous étudierons l'impact de ces mutations sur les étapes d'entrée, d'assemblage et le cycle viral complet dans le contexte du clone infectieux. Par ailleurs, des travaux ont révélé récemment des différences fonctionnelles majeures des glycanes entre les variants du SARS-CoV-2. Aussi, nous proposons de caractériser le rôle joué par les glycanes en amont de S1/S2 et S2' dans le contexte des différents variants du SARS-CoV-2. La forte glycosylation de la protéine S est un trait commun des coronavirus, avec 23 et 33 sites de N-glycosylation pour les protéines spike des coronavirus humains MERS-CoV et HCoV229E, respectivement. Plusieurs sites de N-glycosylation sont localisés à proximité des séquences de clivage de S chez ces deux coronavirus, qui sont également étudiés au laboratoire. Ainsi, nous chercherons à déterminer si comme pour le SARS-CoV-2, les N-glycanes peuvent moduler la maturation et les fonctions d'entrée de S pour le coronavirus humain hautement pathogène MERS-CoV, ainsi que pour le coronavirus endémique HCoV229E.

Since the late 2019, the new human coronavirus SARS-CoV-2 has infected more than 764 million people in the world, leading to more than 7 million deaths. Among the structural proteins of SARS-CoV-2 particle, the Spike glycoprotein (S) is anchored in the virus envelope and constitutes the main determinant of virus entry SARS-CoV-2 spike (S) and the target of host immune response, thus being of great interest for antiviral research. It is constituted of S1 and S2 subunits, which are involved in ACE2 receptor binding and fusion between the viral envelope and the host cell membrane, respectively. Induction of the fusion process, requires S cleavage at the S1/S2 junction and at the S2' site located upstream of the fusion peptide. Interestingly, SARS-CoV-2 spike harbors a 4 residues insertion at S1/S2 junction that is absent in its closest relatives and constitutes a polybasic motif recognized by furin-like proteases. Moreover, S is heavily glycosylated since it harbors 22 N-glycosylation sites. Several glycans are located in the close vicinity of the cleavage sites S1/S2 and S2'. Preliminary data suggest that N-glycans located upstream S2' site (N709, N717, N801), are required for the efficient processing of S and its cell surface expression, while glycans (N603, N616, N657) located upstream S1/S2 cleavage site seem to hide an extra-cleavage site located at R634 residue. Indeed, removal of these glycosylation sites led to the detection of a S1 subunit of lower molecular weight than wild type S1. Moreover, mutation of R634 residue abrogated the cleavage of S N603Q N616Q N657Q mutant, while having no effect in wild type S background. In this context, we would like to further characterize the importance of these N-glycosylation sites for S processing and entry functions. We will seek to characterize the alternative cleavage of S observed in absence of N603, N616, N657 N-glycosylation sites. For this purpose, we will sequence the alternative S1 product, define the residues required for the cleavage and seek to identify the protease involved. We will also study the impact of these mutations on viral entry, assembly and on the complete viral life cycle in the context of SARS-CoV-2 infectious clone. In addition, recent work has revealed major functional differences in glycans between SARS-CoV-2 variants. We therefore propose to characterize the role played by glycans upstream of S1/S2 and S2' in the context of the different SARS-CoV-2 variants. High glycosylation of the S protein is a common feature of coronaviruses, with 23 and 33 N-glycosylation sites for the spike proteins of human coronaviruses MERS-CoV and HCoV229E, respectively. Several N-glycosylation sites are located close to S cleavage sequences in these two coronaviruses, which are also being studied in the laboratory. We will therefore seek to determine whether, as in the case of SARS-CoV-2, N-glycans can modulate the maturation and entry functions of S for the highly pathogenic human coronavirus MERS-CoV, as well as for the endemic coronavirus HCoV229E.