Microscopie de localisation de molécules uniques résolue en temps

Time resolved single molecule localisation microscopy

• Auteur / Autrice : Léa Brito
• Direction : Sandrine Leveque-fort
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique
• Date : Inscription en doctorat le 30/09/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ondes et Matière
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Nanomédecine et Biophotonique (Nanobio)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay

Mots clés

Mots clés libres

Fluorescence

Microscopie

Durée de vie

Super-resolution

Microscopy

Fluorescene

Lifetime

Super-resolution

Résumé

La limite de diffraction qui a longtemps limitée l'observation des systèmes biologiques est actuellement dépassée grâce au développement récent d'approches mêlant l'optique et le contrôle photophysique des émetteurs fluorescents (Prix Nobel 2014). En particulier, le développement des approches de microscopie par super-localisation (dSTORM/PALM) permet en contraignant les molécules fluorescentes qui sont associées de façon spécifique à certaines protéines de l'échantillon à émettre à des instants différents ce qui permet de trouver leur position avec une précision latérale de l'ordre de 10 nm. L'un des principaux défis du domaine est d'extraire l'information de localisation suivant les 3 dimensions et en particulier de trouver des méthodes qui permettent d'obtenir une résolution suivant l'axe optique proche de la résolution latérale, mais également de pourvoir positionner des molécules situées en profondeur dans des échantillons complexes (organoide, embryons, …). Nous avons développé, en collaboration avec l'Institut Langevin, une nouvelle approche basée sur l'introduction d'une excitation structurée qui permet d'introduire une modulation temporelle de l'émission des molécules fluorescentes. Ceci permet de gagner un facteur deux en terme de résolution, mais offre aussi un avantage unique qui est l'uniformité de la résolution quelle que soit la profondeur d'observation. Cette technique appelée Modloc (Nature Photonics 2021) repose en particulier sur un dispositif de détection optique original protégé par un brevet. Nous avons récemment mis en place une nouvelle version de cette illumination structurée permettant d'induire un pas d'interférence variable et d'encoder de façon alternative la position et d'autres paramètres tels que la durée de vie de fluorescence simultanément. Dans le cadre de cette thèse, nous souhaitons pouvoir étudier plus particulièrement ce couplage entre information de position nanométrique et mesure de la durée de vie permettant d atteindre des informations sur l environnement locale des molecules. De nouvelles configurations optique permettant d'introduire la modulation de l'llumination mais également pour detecter la position des molécules et leur signature temporelle à différentes échelles seront mises en place. Le développement de ce nouvel instrument permettra de reouvrir des pans entiers d 'observation en biologie, en particulier avec nos collaborateurs biologistes nous nous intéresserons à l'organisation du cytosquelette (tubuline) impliquée dans la migration des cellules, et aux phénomènes de stress, tension et réparation.

The diffraction limit that has long limited the observation of biological systems is now being overcome thanks to the recent development of approaches combining optics and photophysical control of fluorescent emitters (Nobel Prize 2014). In particular, the development of super-localization microscopy approaches (dSTORM/PALM) makes it possible by constraining fluorescent molecules that are specifically associated with certain proteins in the sample to emit at different times, enabling their position to be found with a lateral precision of the order of 10 nm. One of the main challenges in this field is to extract localization information in 3 dimensions, and in particular to find methods that can achieve a resolution along the optical axis close to the lateral resolution, but also to be able to position molecules located deep inside complex samples (organoids, embryos, etc.). In collaboration with the Institut Langevin, we have developed a new approach based on the introduction of structured excitation, which enables the temporal modulation of fluorescent molecule emission. This not only increases resolution by a factor of two, but also offers the unique advantage of uniform resolution whatever the depth of observation. This technique, called Modloc (Nature Photonics 2021), is based in particular on an original patent-protected optical detection device. We have recently implemented a new version of this structured illumination, enabling us to induce a variable interference step and alternatively encode position and other parameters such as fluorescence lifetime simultaneously. We have recently implemented a new version of this structured illumination, which allows us to induce a variable interference step and alternatively encode position and other parameters such as fluorescence lifetime simultaneously. In the context of this thesis, we would like to study in particular this coupling between nanometric position information and lifetime measurement, enabling us to obtain information on the local environment of molecules. New optical configurations will be set up to introduce modulation of illumination, but also to detect the position of molecules and their time signature at different scales. The development of this new instrument will enable us to reopen entire areas of observation in biology, in particular with our biologist collaborators we will be looking at the organization of the cytoskeleton (tubulin) involved in cell migration, and the phenomena of stress, tension and repair.