Etude des partenaires moléculaires de la cotransmission acétylcholine-glutamate dans les vésicules synaptiques des interneurones cholinergiques striataux.

Study of molecular partners of acetylcholine-glutamate cotransmission in the synaptic vesicles of striatal cholinergic interneurons.

• Auteur / Autrice : Lucille Boyer
• Direction : Véronique Bernard
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cerveau, cognition, comportement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : NeuroSu
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Neuropharmacology of VGLUTs

Mots clés

Mots clés libres

Flim-fret

Vésicules synaptiques

Microscopie de super-résolution

Co-tranmission

CRISPR-Cas9

Senseurs fluorescent d'acétylcholine et de glutamate

Fluorescent sensors of acetylcholine and glutamate

Super resolution microscopy

Flim-fret

Cotranmission

Synaptic vesicles

CRISPR-Cas9

Résumé

Les interneurones cholinergiques striataux (ICS) expriment les transporteurs vésiculaires de l'acétylcholine (VAChT) et du glutamate (VGLUT3) et régulent ainsi le réseau striatal par l'acétylcholine (ACh) et le glutamate (Glu). L'équipe a montré que les vésicules synaptiques des ICS ont le potentiel de stocker et de libérer simultanément ou indépendamment de l'ACh/Glu pour réguler l'activité striatale1. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les ICS libèrent ces deux neurotransmetteurs classiques sont encore largement inconnus. Nous émettons l'hypothèse que VAChT et VGLUT3 interagissent directement ou indirectement par l'intermédiaire de protéines partenaires pour réguler la cotransmission ACh/Glu. L'équipe a déjà identifié deux partenaires potentiels, les protéines membranaires associées aux vésicules VAMP2 et VAMP7, composantes du complexe SNARE, connues pour faciliter la libération d'ACh et de Glu. Objectifs L'objectif de ce projet est de comprendre la complexité morphologique et fonctionnelle de la cotransmission ACh/Glu par les ICS. En utilisant une approche combinant microscopie de super-résolution, FLIM-FRET et mesure de la libération d'ACh et de Glu, ce projet sera organisé autour de trois axes : Axe 1. Analyse de la distribution des partenaires de VAChT et VGLUT3 dans les vésicules synaptiques des ICS Grâce à des approches de microscopie de pointe (super résolution STED), le.la doctorant.e déterminera si VAMP2 et VAMP7 sont présentes dans les vésicules synaptiques immunopositives pour VAChT et VGLUT3. En parallèle, l'équipe du Pr A. Carbone (UMR 7238, SU), est en train de développer une approche computationnelle pour identifier d'autres partenaires de VAChT et VGLUT3 que le.la doctorant.e cherchera à localiser dans les vésicules exprimant VAChT et VGLUT3. Axe 2. Analyse des interactions fonctionnelles entre VAChT/VGLUT3 et leurs partenaires potentiels par FLIM-FRET Pour étudier les interactions Protéine-Protéine (IPP), le.la doctorant.e utilisera la Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) couplée au Transfert d'Energie par Résonance de Förster (FRET), ou FLIM-FRET2. Dans cette méthode, les protéines d'intérêt sont fusionnées à des fluorophores (donneur : eGFP/ accepteur : mCherry). Le FRET entre les deux fluorophores ne peut se produire que lorsque les protéines sont physiquement proches (distance ≤10 nm), et donc très probablement en interaction. Le FRET-FLIM mesure la diminution de la durée de vie à l'état excité du fluorophore donneur sans et avec la présence de l'accepteur. Elle peut donc fournir des données sur les IPP ainsi que des informations spatiales sur les sites subcellulaires où les interactions ont lieu dans les cellules. Pour marquer les protéines d'intérêt, le.la doctorant.e utilisera la méthode « CAKE » (Conditionnal Activation of Knock-in Expression)3, une approche d'édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 pour le marquage d'épitopes. Ce marquage rendra ces transporteurs détectables simultanément, dans les cultures organotypiques de striatum, un modèle adapté à cette étude. Axe 3. Analyse du rôle fonctionnel des partenaires dans la libération d'ACh et de Glu Le.la doctorant.e testera le rôle causal de ces partenaires. Pour cela, il.elle combinera des stratégies de blocage de l'expression des partenaires (shRNA) avec le suivi de la libération d'ACh et de Glu en microscopie confocale à l'aide de senseurs fluorescents de l'ACh et du Glu. Conclusion Ce projet permettra d'identifier les acteurs moléculaires de la cotransmission ACh/Glu. Il devrait avoir un impact profond sur notre compréhension du réseau striatal dont le dysfonctionnement est associé à l'usage de substances ou aux troubles alimentaires et éventuellement accélérer la découverte de biomarqueurs et de thérapies. 1.Cristofari, P. et al. doi: 10.3389/fnmol.2022.991732 2.Wang, S. et al. doi: 10.1142/S1793545819300106 3.Droogers, W. J. et al. doi: 10.1523/ENEURO.0056-22.2022

Striatal cholinergic interneurons (CINs) express vesicular acetylcholine (VAChT) and glutamate (VGLUT3) transporters, and thus regulate the striatal network via acetylcholine (ACh) and glutamate (Glu). The team has shown that CINs synaptic vesicles have the potential to simultaneously or independently store and release ACh/Glu to regulate striatal activity1. However, the molecular mechanisms by which CINs release these two classical neurotransmitters are still largely unknown. We hypothesize that VAChT and VGLUT3 interact directly or indirectly via partner proteins to regulate ACh/Glu cotransmission. The team has already identified two potential partners, the vesicle-associated membrane proteins VAMP2 and VAMP7, components of the SNARE complex, known to facilitate ACh and Glu release. Objectives The aim of this project is to understand the morphological and functional complexity of ACh/Glu cotransmission by CINs. Using an approach combining super-resolution microscopy, FLIM-FRET and measurement of ACh and Glu release, this project will be organized around three axes: Axis 1. Analysis of the distribution of VAChT and VGLUT3 partners in CINs synaptic vesicles Using state-of-the-art microscopy approaches (super-resolution STED), the PhD student will determine whether VAMP2 and VAMP7 are present in synaptic vesicles immunopositive for VAChT and VGLUT3. In parallel, Prof. A. Carbone's team (UMR 7238, SU) is developing a computational approach to identify other VAChT and VGLUT3 partners that the PhD student will seek to localize in vesicles expressing VAChT and VGLUT3. Axis 2. Analysis of functional interactions between VAChT/VGLUT3 and their potential partners using FLIM-FRET To study Protein-Protein Interactions (PPI), the PhD student will use Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) coupled to Förster Resonance Energy Transfer (FRET), or FLIM-FRET2. In this method, proteins of interest are fused to fluorophores (donor: eGFP/acceptor: mCherry). FRET between the two fluorophores can only occur when the proteins are physically close (distance ≤10 nm), and therefore most likely interacting. FRET-FLIM measures the decrease in the excited-state lifetime of the donor fluorophore without and with the presence of the acceptor. It can therefore provide data on PPIs as well as spatial information on the subcellular sites where interactions take place in cells. To tag the proteins of interest, the PhD student will use the 'CAKE' (Conditionnal Activation of Knock-in Expression)3 method, a CRISPR/Cas9-based genome-editing approach for epitope tagging. This tagging will make these transporters detectable simultaneously, in organotypic cultures of striatum, a model suitable for this study. Axis 3. Analysis of the functional role of partners in ACh and Glu release The PhD student will test the causal role of these partners. To this end, he/she will combine strategies for blocking partner expression (shRNA) with monitoring of ACh and Glu release by confocal microscopy using fluorescent sensors ACh and Glu sensors. Conclusion This project will identify the molecular players in ACh/Glu cotransmission. It should have a profound impact on our understanding of the striatal network whose dysfunction is associated with substance use or eating disorders, and potentially accelerate the discovery of biomarkers and therapies. 1.Cristofari, P. et al. doi: 10.3389/fnmol.2022.991732 2.Wang, S. et al. doi: 10.1142/S1793545819300106 3.Droogers, W. J. et al. doi: 10.1523/ENEURO.0056-22.2022