Physiopathologie du nœud sinusal cardiaque: implication de la protéine kinase A

Pathophysiology of the sino-atrial node : implication of protein kinase A

• Auteur / Autrice : Anne Breidenstein
• Direction : Grégoire Vandecasteele
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physiologie et physiopathologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Signalisation et physiopathologie cardiovasculaire
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de pharmacie

Mots clés

Mots clés libres

AMP cyclique

Fréquence cardiaque

Arythmies

Calcium

Régulation sympathique

Maladies du noeud sinusal

Calcium

Sympathetic regulation

Sinus sick syndrome

Arythmias

Cyclic AMP

Heart rate

Résumé

Au cours d'une vie de 70 ans, le cœur humain bat en moyenne plus de 2,5 milliards de fois. Une fréquence cardiaque (FC) rapide est associée à un risque élevé d'événements cardiovasculaires, notamment en cas d'insuffisance cardiaque (IC), tandis qu'au cours du vieillissement, un rythme cardiaque trop lent peut provoquer des vertiges, de la fatigue et des évanouissements et nécessite souvent la mise en place d'un stimulateur cardiaque artificiel. L'origine du rythme cardiaque est un événement électrique généré par un petit groupe de cellules dites « pacemaker » (CP) du nœud sino-atrial, situé dans l'oreillette droite du cœur. Les CP déclenchent des potentiels d'action (PA) spontanés, mais les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette activité ne sont pas entièrement élucidés1, 2. La fréquence des PA est régulée par le système nerveux autonome, ce qui permet au débit cardiaque de s'adapter aux besoins de l'organisme. Le système nerveux sympathique accélère la FC en libérant de la noradrénaline qui se lie aux récepteurs β-adrénergiques (β-AR), entraînant une augmentation d'AMP cyclique (AMPc). L'AMPc active deux cibles majeures qui contrôlent la fréquence d'émission des PA : les canaux cationiques activés par l'hyperpolarisation (HCN) et la protéine kinase AMPc-dépendante (PKA) qui augmente l'automaticité de la CP en contrôlant les flux de Ca2+. L'importance de la PKA est attestée par l'absence d'effet chronotrope positif d'une stimulation β-AR chez les souris exprimant un inhibiteur sélectif de cette kinase3. Le cœur exprime deux sous-types de PKA (type I et II) qui diffèrent par leurs sous-unités régulatrices, RIα et RIIα. A ce jour, leur contribution respective à la stimulation β-AR du cœur est mal connue. Récemment, notre équipe a montré que l'invalidation du gène Prkar1A codant pour la sous-unité RIα dans les myocytes ventriculaires de souris adultes augmente l'activité PKA et la contraction cardiaque4. Ces résultats soulèvent la question du rôle de ce gène dans l'automatisme cardiaque. Afin de répondre à cette question, nous avons développé un nouveau modèle de souris triple transgénique dans lequel une recombinase Cre inductible est exprimée sous contrôle du promoteur HCN45, permettant le knock-out de Prkar1A spécifiquement dans les CP et le système conducteur. L'induction par le tamoxifène permet également l'expression d'un gène codant pour la protéine fluorescente rouge Tomato dans les CP. Nos résultats préliminaires montrent que l'invalidation de Prkar1A dans les CP augmente la FC intrinsèque in vivo lorsque le système nerveux autonome est bloqué (Figure 1 en Annexe). Ce projet de thèse visera à caractériser le phénotype rythmique de ces souris en mesurant l'ECG in vivo et dans des cœurs isolés. L'activité de la PKA, l'homéostasie du calcium, les PA et le courant Ca2+ de type L seront enregistrés dans des CP isolées afin de caractériser les mécanismes potentiels par lesquels la PKA de type I régule l'activité électrique de ces cellules. Puisque nous avons observé que le knock-out de Prkar1A dans les myocytes ventriculaires conduit à une insuffisance cardiaque au cours du vieillissement, les conséquences à court et long terme du knock-out de Prkar1A dans les CP et le rythme cardiaque seront évaluées. Afin de mieux comprendre le rôle de la PKA de type I dans le contrôle de l'automatisme cardiaque humain, le gène PRKAR1A sera inactivé dans les cellules souches pluripotentes induites humaines et ces cellules seront différenciées en PC en utilisant des protocoles publiés6, 7. L'impact du knock-out de Prkar1A sera évalué sur la fréquence de battement de cultures 2D de CP humaines et les mécanismes de régulation associés seront caractérisés. L'ensemble de ces résultats devrait permettre de clarifier certains des mécanismes fondamentaux par lesquels l'adrénaline accélère le cœur, et les conséquences physiopathologiques de leur dérégulation sur la fonction du nœud sino-atrial et les arythmies cardiaques.

In a 70-years life time, an average human heart beats more than 2.5 billion times. A fast heart rate (HR) at rest is associated with a higher risk of cardiovascular events, especially in heart failure (HF), whereas during aging, a slow heartbeat can provoke dizziness, fatigue and fainting and often requires the implementation of an artificial pacemaker. The origin of the heartbeat is an electrical event generated by a small group of pacemaker cells (PC) in the sino-atrial node which is located in the heart's right atrium. PC cells fire spontaneous action potentials (AP) but the molecular mechanisms underlying the regulation of AP firing by PC cells are not fully elucidated1, 2. AP firing frequency is regulated by the autonomic nervous system thereby enabling the cardiac output to adapt to the body's needs. The sympathetic nervous system accelerates HR by releasing norepinephrine which binds to β-adrenergic receptors (β-AR), leading to an increase in cyclic AMP (cAMP). cAMP in turn activates two major targets that control the frequency of AP firing: hyperpolarization-activated cation channels (HCN) that directly contribute to the spontaneous depolarization of PC, and cAMP-dependent protein kinase (PKA) that control Ca2+ fluxes and thereby increase PC automaticity. The importance of PKA is attested by the absence of β-AR stimulation of HR in mice expressing a highly selective PKA inhibitor3. The heart expresses two main subtypes of PKA (type I and II) differing in their regulatory subunits, RIα and RIIα. The respective contribution of these PKA subtypes to β-AR stimulation of the heart is not well understood. Recently, our team showed that invalidation of the Prkar1A gene encoding RIα in adult mouse ventricular myocytes increases PKA activity and cardiac contraction.4 These results raise the question of the role of this gene in the regulation of cardiac automatism. To answer this question, we have developed a novel triple transgenic mouse model in which a tamoxifen-inducible Cre recombinase is expressed under the control of the HCN4 promoter5, enabling knockout of Prkar1A specifically in PCs and in the cardiac conducting system. Tamoxifen induction also enables expression of a marker gene encoding the red fluorescent protein Tomato in PCs. Our preliminary results show that Prkar1A gene invalidation specifically in pacemaker cells increases the intrinsic heart rate in vivo when the autonomic nervous system is blocked (Appendix Figure 1). This result demonstrates for the first time that RIα and thus PKA type I controls cardiac automatism. This thesis project will aim to further characterize the rhythmic phenotype of these mice by measuring ECG in vivo and in isolated perfused hearts. PKA activity, intracellular calcium homeostasis, AP and L-type Ca2+ current will be recorded in isolated PC to characterize the potential mechanisms by which PKA type I regulate the electrical activity of these cells. Because we observed that knockout of Prkar1A in ventricular myocytes leads to heart failure upon aging, both the short and long term consequences of Prkar1A knockout in PC on cardiac rhythm will be evaluated. A special attention will be paid to detect cardiac arrhythmias and to study their mechanisms. In order to gain some insights into the role of PKA type I in the control of human cardiac automaticity, the PRKAR1A gene will be knocked out in human induced pluripotent stem cells and these cells will be differentiated into PC using published protocols6, 7. The impact of RIα knockout will be evaluated on the beating frequency of 2D cultures of human PC and the regulatory mechanisms associated will be characterized using similar techniques as used in mouse. Taken together, these results should clarify some of the fundamental molecular mechanisms by which epinephrine accelerates the heart, and the pathophysiological consequences of their deregulation on the function of the sino-atrial node.