Cartographie et ingénierie de l'affinité de liaison et de la spécificité des anticorps

Mapping and engineering binding affinity and specificity in antibodies

• Auteur / Autrice : Matilde Pattanaro
• Direction : Clément Nizak, Olivier Rivoire
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : Physique en Ile de France
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Jean Perrin

Mots clés

Mots clés libres

Anticorps

Affinité de liaison

Physique statistique

Speécificité

Antibodies

Binding affinity

Statistical physics

Specificity

Résumé

Résumé: Nous nous interrogeons sur la relation entre la séquence protéique et la fonction protéique en utilisant les anticorps comme système modèle. Pour ce faire, nous développons une approche basée sur des expériences in vitro à haut débit, associées à des analyses de données et à la modélisation (modèles physiques et apprentissage automatique). La structure des anticorps issus d'un répertoire se compose d'une boucle de surface hautement diversifiée, susceptible de se lier à des antigènes très variés, et d'une charpente sous-jacente moins diversifiée. En combinant le phage display et le séquençage à haut débit de l'ADN, nous mesurons l'affinité de liaison d'anticorps synthétiques à des antigènes cibles. Nous commencerons par modéliser statistiquement la relation « séquence de boucle-affinité » afin de prédire de nouveaux anticorps avec des spécificités de liaison sur mesure. Ensuite, nous étendrons l'analyse et la modélisation des données statistiques pour dévoiler comment la boucle de surface est couplée à la charpente, et pour cartographier les contributions à l'affinité de liaison et à la stabilité thermique au sein des séquences d'anticorps. Enfin, nous analyserons comment la réponse à la sélection et à l'évolution (potentiel de sélection, évolvabilité) des répertoires dépend de la stabilité thermique de la charpente. Projet de doctorat: Notre projet aborde le problème de la relation séquence-fonction dans les protéines en utilisant les anticorps comme système modèle. Cette question concerne l'immunité adaptative ainsi que les origines évolutives de cet important composant de la réponse immunitaire des vertébrés. Elle est également d'un grand intérêt dans le domaine de l'ingénierie des protéines, comme en témoigne le prix Nobel de chimie 2018, avec de nombreuses applications dans l'industrie pharmaceutique. La structure des régions variables des anticorps (qui définissent leur affinité de liaison et leur spécificité) consiste en des boucles de surface en contact direct avec les antigènes cibles et des régions de cadre sous-jacentes. La grande diversité de séquences des régions variables des anticorps est un élément clé de la réponse immunitaire adaptative, car elle permet aux répertoires d'anticorps de posséder des potentiels de liaison à une diversité immense d'antigènes cibles. Cette diversité résulte d'abord de la recombinaison de segments de séquence déterminés génétiquement. De plus, la séquence d'une des boucles, appelée VH-CDR3, présente de loin le plus haut niveau de diversité car elle est également partiellement générée par un processus aléatoire se produisant à la jonction entre les segments. Nous définissons comme ''charpente'' des régions variables d'anticorps la partie génétiquement codée de leur séquence, c'est-à-dire les régions de cadre et une partie des boucles de surface, et comme ''boucle CDR3'' la partie somatiquement définie du VH-CDR3 (typiquement 4-6 acides aminés). Étant donné que la boucle CDR3 est la plus diversifiée, elle est généralement considérée comme ayant la principale contribution à l'affinité de liaison et à la spécificité pour des antigènes très divers. Cependant, la liaison n'est pas entièrement déterminée par la boucle CDR3. Le couplage entre la boucle CDR3 et la charpente a été largement documenté, les mutations des régions de cadre affectant la conformation des boucles et donc l'affinité de liaison, ce qui a un impact important lors de la maturation de l'affinité (impliquant des mutations dans l'ensemble de la région variable). De plus, les applications des anticorps thérapeutiques nécessitent généralement une ingénierie empirique en raison de ce couplage. Relier la séquence des anticorps à la liaison nécessite donc de considérer les acides aminés des régions variables au-delà de la boucle CDR3. Au cours des 10 dernières années, une nouvelle approche a été développée pour aborder ce problème en utilisant le séquençage à haut débit des répertoires d'anticorps pour construire des modèles statistiques qui prédisent l'affinité à partir des données de séquence uniquement. Les technologies à cellule unique produisent de telles données de séquence et phénotypiques à grande échelle sur les répertoires immunitaires naturels, mais avec des limitations importantes pour la modélisation mathématique, les forces de sélection agissant in vivo n'étant pas contrôlées et difficiles à caractériser. De plus, les diversités des répertoires naturels dépassent les capacités actuelles de séquençage de l'ADN. Une alternative consiste à réaliser des expériences de sélection/maturation de l'affinité in vitro dans des conditions contrôlées sur des répertoires d'anticorps synthétiques en utilisant le phage display avec lecture de séquençage de l'ADN à haut débit, ce qui surmonte ces limitations. En couplant des méthodes et des concepts issus de la physique statistique/apprentissage automatique, les données de haute qualité de ces expériences in vitro peuvent être utilisées pour prédire des séquences avec des fonctions améliorées ou pour décomposer un phénotype de séquence en différents composants physiques, par exemple, l'affinité de liaison et la stabilité thermique, comme démontré dans le cas d'un autre type de protéine de liaison. Nous développons cette approche dans le contexte des anticorps pour répondre à plusieurs questions ouvertes : 1) Comment prédire l'affinité de liaison à partir des séquences de la boucle CDR3? 2) Comment prédire le couplage boucle CDR3-charpente? 3) Comment identifier les charpentes d'anticorps les plus propices à la sélection et à la maturation de l'affinité? 4) Comment relier ce potentiel de maturation des charpentes (ici appelé évolvabilité) à des propriétés biophysiques telles que la stabilité thermique? Dans des travaux précédents, nous nous sommes concentrés sur (3) et avons démontré comment une approche statistique peut identifier des charpentes d'anticorps avec des potentiels de sélection accrus. Actuellement, nous finalisons un travail qui résout (1) en utilisant des bibliothèques d'anticorps avec des « boucles CDR3 » randomisées sur 4 acides aminés en adaptant les algorithmes de nos collaborateurs. Nous avons également produit des données expérimentales avec des séquences d'anticorps qui sont mutées aléatoirement sur toute leur séquence (imitant les mutations lors de la maturation de l'affinité) pour aborder (2) dans le cadre du projet de l'un de nos doctorants actuels. Notre objectif dans les années à venir est d'exploiter et d'étendre nos résultats passés et de nouvelles données pour résoudre conjointement les questions (2) et (4). Nous prévoyons de procéder comme suit, dans le cadre du programme i-Bio : 1) Étendre notre modélisation actuelle à nos nouvelles données sur des répertoires plus diversifiés, voir rotation ci-dessous. 2) Montrer comment nous pouvons appliquer des méthodes statistiques développées par d'autres pour inférer une cartographie entre la séquence et à la fois l'affinité de liaison et la stabilité thermique, à partir de nos données de sélection dans lesquelles les anticorps sont mutés aléatoirement sur toute leur séquence. C'est le projet actuel de l'un de nos doctorants. Les prédictions doivent être vérifiées par un test expérimental sur la stabilité thermique. Contribuer au développement d'un tel test constituerait la première partie de la thèse, y compris la calibration avec des mesures standard de stabilité des protéines. Les résultats de ce travail devraient mener à une première publication significative. 3) Analyser avec cette combinaison d'expériences et de modélisation statistique les charpentes d'anticorps que nous avons identifiées comme ayant des potentiels de sélection différents et tester l'hypothèse que ces différences sont associées à des différences de stabilité thermique. Ce serait la deuxième partie d'un projet de thèse où l'étudiant combinerait les méthodes computationnelles apprises lors de la rotation et les méthodes expérimentales développées pendant la première partie de la thèse pour mener de manière autonome un nouveau projet. Approches expérimentales et/ou théoriques: Notre approche expérimentale combine le phage display pour anticorps et le séquençage d'ADN à haut débit (Illumina) appliqués à des répertoires d'anticorps synthétiques conçus sur mesure. Ces outils sont bien établis dans notre groupe. Pour ce projet, nous mettrons en place un test de stabilité des anticorps à grande échelle en adaptant une méthode publiée basée sur le phage display au format Fab, qui nécessite un repliement correct des domaines VH et VL pour leur association adéquate. Notre approche théorique combine la physique statistique et l'apprentissage automatique pour déduire les paramètres de modèles physiques interprétables à partir des données à haut débit générées expérimentalement. Pour ce projet, nous développerons des méthodes que nous et d'autres avons précédemment appliquées aux anticorps ainsi qu'à d'autres protéines.

Abstract: We ask how protein sequence relates to protein function using antibodies as a model system. For this, we develop an approach based on high-throughput in vitro experiments with data analysis and modeling (physics models and machine learning). The structure of antibodies from a repertoire consists in a highly diverse surface loop, potentially binding highly diverse antigens, and an underlying scaffold of lesser diversity. Combining phage display and high-throughput DNA sequencing, we measure the binding affinity of synthetic antibodies to target antigens. We will first perform statistical data modeling of the ‘loop sequence-affinity' relation to predict new antibodies with tailored binding specificities. Next, we will extend statistical data analysis/modeling to unravel how the surface loop is coupled to the scaffold, and map contributions to binding affinity and thermal stability over antibody sequences. Finally, we will analyze how the response to selection and evolution (selection potential, evolvability) of repertoires depends on scaffold thermal stability. Project: Our project addresses the sequence-function problem in proteins using antibodies as a model system. This question pertains to adaptive immunity as well as the evolutionary origins of this important component of the vertebrate immune response. This question is also of high interest in the field of protein engineering, as acknowledged by the 2018 Nobel prize in Chemistry, with many applications in the pharmaceutical industry. The structure of antibody variable regions (which define their binding affinity and specificity) consists of surface loops in direct contact with target antigens and underlying framework regions (Figure 1). The high sequence diversity of antibody variable regions is a key component of the adaptive immune response, as it endows antibody repertoires with potential binders to a vast diversity of target antigens. This diversity results first from recombination of genetically determined sequence segments. In addition, the sequence of one of the loops, called VH- CDR3, displays by far the highest level of diversity as it is also partly generated through a random process occurring at the junction between segments. We define as ‘scaffold' of antibody variable regions the genetically encoded part of their sequence, i.e. the framework regions and part of the surface loops, and ‘CDR3 loop' the somatically defined part of the VH-CDR3 (typically 4-6 amino-acids). As the CDR3 loop is the most diverse, it is generally considered to have the main contribution to binding affinity and specificity to highly diverse target antigens. However, binding is not fully determined by the CDR3 loop. Coupling between CDR3 loop and scaffold has been extensively documented, with mutations of framework regions affecting the conformation of loops and thus binding affinity, resulting in a large impact during affinity maturation (involving mutations in the entire variable region). In addition, therapeutic antibody applications generally require empirical engineering owing to this coupling. Relating antibody sequence to binding thus requires to consider amino-acids of variable regions beyond the CDR3 loop. In the past 10 years, a new approach has been developed to address this problem by harnessing antibody repertoire high-throughput sequencing to build statistical models that predict affinity from sequence data alone. Single-cell technologies (to which CN has contributed in the past) produce such large-scale sequence and phenotypic data on natural immune repertoires, but with important limitations for mathematical modeling as selection forces acting in vivo are not controlled and difficult to characterize. Furthermore, natural repertoire diversities exceed current DNA sequencing capacities. An alternative is to perform in vitro selection/affinity maturation experiments in controlled conditions on synthetic antibody repertoires using antibody phage display with high-throughput DNA sequencing read-out, which overcome these limitations. By coupling methods and concepts from statistical physics/machine learning, the high-quality data from such in vitro experiments can be used to predict sequences with improved functions or to decompose a sequence phenotype into different physical components, e.g., binding affinity and thermal stability as demonstrated in the case of another type of binding protein. We are developing this approach in the context of antibodies to address several open questions: 1) How to predict binding affinity from CDR3 loop sequences? 2) How to predict the CDR3 loop-scaffold coupling? 3) How to identify antibody scaffolds most conductive to selection and affinity maturation? 4) How to relate this scaffold potential for maturation (coined here evolvability) to biophysical properties such as thermal stability? In past works, we focused demonstrated how a statistical approach can identify antibody scaffolds with increased potentials for selection. Currently, we are completing work that solves (1) using antibody libraries with 4 randomized amino-acid ‘CDR3 loops' by adapting our collaborators' algorithms. We have also produced experimental data with antibody sequences that are randomly mutated across all their sequence (mimicking mutations during affinity maturation) to address (2) for the project of one of our current PhD students. Our objective in the coming years is to exploit and extend our past results and new data to jointly solve questions (2) and (4). We plan to proceed as follows, in the context of the i-Bio program: 1. Extend our current modeling to our new data on more diverse repertoires, see rotation below. 2. Show how we can apply statistical methods developed by others 12 to infer a mapping between sequence and both binding affinity and thermal stability, from our selection data in which antibodies are randomly mutated across all their sequence. This is the current project of one our PhD students. The predictions need to be verified with an experimental assay on thermal stability. Contributing to developing such an assay would be the first part of the PhD, including calibration with standard protein stability measurements. The results of this work should lead to a first significant publication. 3. Analyze with this combination of experiments and statistical modeling the antibody scaffolds that we identified to have different selective potentials 2,14 and test the hypothesis that these differences are associated with differences in thermal stability. This would be the second part of a PhD project where the student would combine the computational methods learned during the rotation and the experimental methods developed during the first part of the PhD to complete autonomously a new project. - Experimental and/or theoretical approaches: Our experimental approach combines antibody phage display and high-throughput DNA sequencing (Illumina) applied to custom-made synthetic antibody repertoires. These tools are well-established in our group. For this project, we will set up a large-scale antibody stability assay by adapting a published method based on phage display in the Fab format 4 which requires proper folding of VH and VL for their correct association. Our theoretical approach combines statistical physics and machine learning to infer the parameters of interpretable physical models from the high-throughput data generated experimentally. For this project, we will develop methods that we and others have previously applied to antibodies as well as other proteins.