Microscopie temps réel en régime de super localisation pour le suivi du transport intraneuronal à l'échelle du moteur moléculaire

Real-time two-photon microscopy for intraneuronal transport studies at the single molecular motor scale.

• Auteur / Autrice : Alexandre Clausolles
• Direction : François Marquier
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ondes et Matière
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Lumière, Matière et Interfaces
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Ecole Normale Supérieure Paris-Saclay

Mots clés

Mots clés libres

Suivi de particules uniques

Super-localisation

Holographie numérique

Génération de seconde harmonique

Matrice de micro-miroirs

Biophotonique

Single-particule tracking

Superlocalization

Holography

Second harmonique generation

Digital micromirror device

Biophotonics

Résumé

Nous présentons un dispositif de microscopie à deux photons permettant de mesurer les paramètres du transport intraneuronal dans des échantillons 3D épais, dans un régime de super localisation (en dessous de la limite de diffraction) grâce à la réponse optique non linéaire de nanoparticule (génération de seconde harmonique (SHG)). Pour suivre la nanoparticule au cours de son mouvement, nous utilisons une matrice de micromiroirs (DMD) qui réalise un hologramme numérique et modifie la position de focalisation du laser d'excitation. Nous créons un pattern d'excitation à proximité de la nanoparticule et collectons le signal émis pour chaque position de focalisation, ce qui nous permet de localiser la particule en temps réel à une cadence proche de la milliseconde et avec une précision de localisation inférieure à 5 nm, par l'approche du maximum de vraisemblance. Nous utilisons également les hologrammes pour corriger la forme du faisceau d'excitation et obtenir ainsi un spot limité uniquement par la diffraction au foyer du laser. La méthode de suivi a été testée sur des nanosphères de BaTiO3 internalisées dans des cellules vivantes, montrant des trajectoires très directionnelles. Notre objectif est d'obtenir également l'orientation des nanoparticules au cours du mouvement, pour compléter les paramètres de transport intraneuronal (mesure du mouvement de rotation des vésicules transportant les émetteurs). Ce paramètre supplémentaire est utile pour comprendre comment les moteurs moléculaires sont entraînés le long des microtubules [2, 3]. Le signal des nanoparticules dépend de leur axe cristallin et de la polarisation du laser d'excitation [4]. En faisant tourner la polarisation incidente et en détectant le long de deux polarisations orthogonales, nous sommes capable de suivre à la fois le mouvement de translation et la rotation de la nanoparticule.

We developpe a two-photon microscopy device for measuring intraneuronal transport parameters in thick 3D samples, in a super-localization regime (below the diffraction limit) thanks to the nanoparticle's nonlinear optical response (second harmonic generation (SHG)). To track the nanoparticle as it moves, we use a digital micromirror device (DMD) that create digital holograms that change the focus position of the excitation laser. We create an excitation pattern close to the nanoparticle and collect the signal emitted for each focusing position, enabling us to localize the particle in real time at a rate close to the millisecond and with a localization precision of less than 5 nm, using the maximum likelihood approach. We also use holograms to correct the shape of the excitation beam, thus obtaining a diffraction limited spot at the laser focus. The tracking method has been tested on BaTiO3 nanospheres internalized in living cells, showing highly directional trajectories. We aim at completing the intraneuronal transport parameters with the measurement of the rotational movement of vesicles. This additional parameter is useful to understand how the molecular motors are driven along the microtubules. The nanoparticles SH signal depends on their crystalline axis and polarization of the excitation laser. By rotating the incident polarization and detecting along two orthogonal polarizations, we are able to track the translation motion as well as the rotation of the nanocrystal.