Analyse des interactions entre peptides antimicrobiens et peptidoglycane par photomarquage d'affinité couplé à la spectrométrie de masse

Analysing interactions between antimicrobial peptides and peptidoglycan by affinity photocrosslinking coupled to mass spectrometry

• Auteur / Autrice : Bruneika Akomedi
• Direction : Emmanuelle Sachon
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Moléculaire
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie moléculaire de Paris Centre
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des Biomolécules
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biomolecules: Analysis, Molecular and Cellular Interactions

Mots clés

Mots clés libres

Peptide antimicrobien

Membranes

Photomarquage

Antimicrobial peptide

Membranes

Affinity photocrosslinking

Résumé

Les peptides antimicrobiens (AMP) constituent une large classe de peptides ayant une activité prometteuse contre les bactéries ou les champignons et représentent des points de départ intéressants pour le développement d'approches thérapeutiques pour traiter les infections bactériennes. De nombreux AMP agissent en interagissant avec les membranes lipidiques bactériennes et potentiellement avec des composants de la paroi cellulaire tels que le peptidoglycane (PGN), bien qu'il existe très peu de preuves directes. Nous avons récemment isolé le DMS-DA6, AMP montrant une activité spécifique envers les bactéries Gram-positives. Les parois cellulaires Gram-négatives et Gram-positives diffèrent grandement en termes de glycoconjugués de surface. Dans le cas des bactéries Gram-positives, une couche très épaisse de PGN et de lipotéichoïques chargés négativement se trouve autour de la bactérie. Le PGN et le LTA pourraient agir comme des « éponges » peptidiques, augmentant leur concentration locale, ou comme des « pièges » peptidiques, les éloignant de la membrane. Nous pensons que DMS-DA6 interagit avec le PGN, et notre objectif est d'obtenir des preuves directes des interactions DMS-DA6/PGN et d'identifier les motifs structuraux impliqués dans ces interactions par photomarquage d'affinité couplé à la MS sur des modèles membranaires et des bactéries vivantes, et de caractériser ces interactions par calorimétrie. L'objectif à long terme est de concevoir des AMP optimisés. Nous utiliserons deux approches complémentaires de photomarquage dans des systèmes modèles ou des bactéries vivantes. Premièrement, le peptide portera une fonction photoactivable, qui pourra facilement être insérée dans la séquence par synthèse peptidique en phase solide. Nous visons ainsi à identifier des partenaires glycoconjugués, sur la base de l'expertise que nous avons développée pour l'étude des interactions peptides/lipides. Ces peptides seront utilisés en interaction avec des PGN extraits de bactéries, ou directement sur des bactéries vivantes une fois le processus analytique bien établi. En parallèle, nous souhaitons développer une approche nouvelle et originale pour étudier les interactions PGN/AMP en introduisant métaboliquement une fonction photoréactive dans le peptide tige du PGN. Cette approche repose sur l'ingénierie biochimique du PGN, utilisant soit des acides aminés D modifiés, soit des substrats de Sortase A chimiquement modifiés. De telles approches ont déjà été utilisées pour introduire des fonctions réactives (alcyne, azoture, thiols…) pour l'introduction d'un post-marquage ou de fluorophores sur des bactéries vivantes, mais à notre connaissance, il n'a jamais été utilisé pour introduire une fonction photoactivables. Ce projet devrait fournir des informations précieuses sur les interactions AMP/PGN. Il donnera un aperçu du mécanisme général de perméation membranaire par les AMP. Cela devrait aider à prédire l'activité des AMP sur les souches bactériennes et nous permettre de rationaliser la conception de nouveaux AMP avec des séquences optimisées pour un meilleur ciblage des bactéries. Ce projet de thèse se situe à l'interface de la chimie et de la biochimie et fera appel à un large éventail de techniques : synthèse peptidique, spectrométrie de masse, culture cellulaire, membranes modèles, etc...toutes disponibles au laboratoire d'accueil (LBM).Ce projet de thèse sera encadré par Emmanuelle Sachon (HDR) et Astrid Walrant (HDR en préparation), dont les expertises englobent la spectrométrie de masse, le photomarquage par affinité, les peptides actifs membranaires et la caractérisation des interactions biomoléculaires.

Antimicrobial peptides (AMPs) are a broad class of peptides with promising activity against bacteria or fungi and represent interesting starting points for the development of new therapeutic approaches to treat bacterial infections. Many AMPs act by interacting with bacterial lipid membranes and potentially cell-wall components such as peptidoglycan (PGN), although there are very few direct pieces of evidence of the latter. We recently isolated DMS-DA6, an AMP showing a specific activity towards Gram-positive bacteria 1. Gram-negative and Gram-positive cell walls differ greatly in terms of surface glycoconjugates. In the case of Gram-positive bacteria, a very thick layer of PGN and negatively charged lipoteichoic are found in the most outer part of the bacteria. PGN and LTA could act as peptide “sponges”, increasing their local concentration, or as peptide “traps”, keeping them away from the lipid membrane. We believe DMS-DA6 interacts with PGN but so far, we only have indirect evidence for this interaction. Our objective is to obtain direct evidence of DMS-DA6/PGN interactions and identify the structural patterns involved in these interactions using affinity photocrosslinking coupled to MS on reconstituted models and live bacteria, and characterise these interactions by calorimetry. The long-term objective is to design new AMPs with optimised sequences. We will use two complementary affinity photocrosslinking approaches in model systems or live bacteria. First, the peptide will carry a photolabel, that can easily be inserted in the sequence by solid-phase peptide synthesis. With such a design, we aim to identify glycoconjugate partners, based on the expertise we developed for the study of peptide/lipid interactions 2–4. These peptides will be used in interaction with PGN extracted from bacteria, or directly on live bacteria once the analytical process is well established. In parallel, we want to develop a new and original approach to study PGN/AMP interactions by metabolically introducing a photoreactive label in the stem peptide of PGN. This approach relies on biochemical engineering of PGN 5, using either modified D-amino acids 6,7 or chemically modified Sortase A substrates 8. Such approaches have previously been used to introduce molecular handles for post-labeling (alkyne, azide, thiols ) or fluorophores on live bacteria, but to our knowledge, it has never been used to introduce a photoreactive label. This project should yield valuable information on AMP/PGN interactions. It will give insight on the general mechanism of membrane permeation by AMPs. It should help predict the activity of AMPs on bacterial strains and enable us to rationalise the design of new AMPs with optimised sequences for better bacteria targeting. This project is at the interface of chemistry and biochemistry and will involve a large set of techniques: peptide synthesis, mass spectrometry, cell culture, model membranes, etc...all available at the host laboratory (LBM).This PhD project will be supervised by Emmanuelle Sachon (HDR) and Astrid Walrant (HDR in preparation), whose expertise encompass mass spectrometry, affinity photolabelling, membrane active peptides and characterisation of biomolecular interactions.