Microscopie innovante pour sonder la dynamique d'auto-assemblage de virus uniques dans un milieu complexe

Innovative microscopy to probe the self-assembly dynamics of single viruses in a complex environment

• Auteur / Autrice : Roméo Suss
• Direction : Guillaume Tresset, Karen Perronet
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : Physique en Ile de France
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Physique des Solides
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay

Mots clés

Mots clés libres

Auto-assemblage

Tirfm

ISCAT

Virus

Self-assembly

ISCAT

Tirfm

Virus

Résumé

Le projet de thèse a pour principal objectif d'élucider la dynamique d'empaquetage du génome dans une capside virale icosaédrique à l'échelle de la particule unique. Nous développons un montage optique quasi unique (voir photo) combinant la microscopie de fluorescence à réflexion totale interne (TIRFM) et la microscopie interférométrique à diffusion (iSCAT) permettant de visualiser en temps réel des molécules par fluorescence et par diffusion de la lumière. Nous sommes en mesure pour le moment de suivre par TIRFM des évènements individuels d'accrochage/décrochage de protéines virales sur des molécules d'ARN greffées à un substrat de verre (voir schéma). Des milliers de virus en cours d'assemblage sont ainsi observés simultanément, et pour chacun d'eux, les traces d'évolution de l'intensité de fluorescence en fonction du temps sont extraites par analyse d'image. Ces traces sont ensuite interprétées avec un algorithme de recherche de marches s'appuyant sur une technique de « machine learning ». Grâce aux milliers de signaux traités par le code, les grandeurs thermodynamiques pertinentes que sont le temps moyen d'accroche et le temps moyen de résidence des protéines sont estimées avec une précision encore inégalée. La thèse consistera à poursuivre ces investigations en commençant par finaliser le couplage TIRFM/iSCAT. Des échantillons biologiques seront préparés à partir d'un virus modèle de plante puis des mesures seront réalisées à différentes concentrations en protéines virales. Les images seront analysées via d'éventuelles améliorations sur les codes existants pour déduire ensuite les grandeurs thermodynamiques. Idéalement, nous cherchons à estimer le paysage d'énergie libre de la particule virale. Des expériences d'auto-assemblage en présence d'un agent d'encombrement seront ensuite initiées afin de s'approcher des conditions physicochimiques du milieu intracellulaire. Des mesures de diffusion des rayons X résolue en temps avec une source synchrotron seront réalisées pour complémenter ces données. Le·a candidat·e aura une formation en physique avec un intérêt pour les systèmes biologiques et la programmation sous Python.

The main aim of this thesis project is to elucidate the dynamics of genome packaging in an icosahedral viral capsid at the single-particle scale. We are developing a quasi-unique optical setup (see photo) combining total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT), enabling real-time visualization of molecules by fluorescence and light scattering. We are currently able to use TIRFM to track individual viral protein attachment/detachment events on RNA molecules grafted to a glass substrate (see diagram). Thousands of viruses in the process of assembly are observed simultaneously, and for each one, traces of the evolution of fluorescence intensity as a function of time are extracted by image analysis. These traces are then interpreted using a “machine learning” algorithm. Thanks to the thousands of signals processed by the code, the relevant thermodynamic quantities of mean binding time and mean protein residence time are estimated with unprecedented accuracy. This thesis will pursue these investigations, starting with the finalization of the TIRFM/iSCAT coupling. Biological samples will be prepared from a plant model virus, and measurements will be taken at different viral protein concentrations. The images will be analyzed by means of possible improvements to existing codes, and the thermodynamic quantities will then be deduced. Ideally, we aim to estimate the free energy landscape of the viral particle. Self-assembly experiments in the presence of a hindering agent will then be initiated to approximate the physicochemical conditions of the intracellular medium. Time-resolved X-ray scattering measurements with a synchrotron source will be carried out to complement these data. The candidate will have a background in physics, with an interest in biological systems and Python programming.