Décryptage à résolution atomique du paysage énergétique complexe de la chaperonne humaine HSP90 à l'aide d'outils de RMN et d'IA avancés

Deciphering the complex energy landscape of the human chaperone HSP90 at atomic resolution using advanced NMR and AI methods

• Auteur / Autrice : Diane D'ESQUERMES
• Direction : Jérôme Boisbouvier, Ewen Lescop
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2024
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Groupe de RMN biomoleculaires

Mots clés

Mots clés libres

Rmn

Biologie Structurale

Hsp90

Spectroscopie

Nmr

Structural Biology

Hsp90

Spectroscopy

Résumé

HSP90 est une protéine essentielle dans le maintien du repliement de multiples protéines humaines. Elle est notamment impliquée dans le repliement de nombreuses protéines oncogènes, et des niveaux élevés d'expression ont été associés à la prolifération des tumeurs. Cette machinerie moléculaire complexe est connue pour subir des réarrangements conformationnels massifs tout au long de son cycle fonctionnel. La cristallographie aux rayons X et la cryoEM ont fourni des structures instantanées à haute résolution de cette machinerie humaine en complexe avec des cochaperones et des protéines clientes, mais n'ont pas réussi à fournir les informations cinétiques et temporelles nécessaires à une compréhension complète de son mécanisme. Il existe donc un besoin pressant d'englober non seulement les conformations natives de l'état fondamental de HSP90, mais aussi tous les autres conformères en échange avec elle. Cependant, cette mission est complexe, car beaucoup de ces conformères ne sont peuplés que de manière transitoire (moins de quelques pour cent de la population totale/temps), échappant souvent à la détection par les techniques biophysiques et structurales standard. Au cours des quinze dernières années, la spectroscopie RMN est devenue un outil puissant pour caractériser la dynamique et les états peu peuplés des protéines à une résolution atomique. Le développement d'expériences basées sur les échanges chimiques, telles que la dispersion de la relaxation de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) et le transfert de saturation des échanges chimiques (CEST), a été au cœur du succès de la RMN dans ce contexte. Associées à des outils informatiques avancés, ces expériences permettent d'extraire des paramètres cinétiques, des attributs thermodynamiques et des données structurelles concernant ces états ‘invisibles'. Cependant, malgré les progrès significatifs réalisés dans ce domaine, des défis subsistent, en particulier lorsque les processus d'échange impliquent plus de deux états conformationnels. Alors que des techniques telles que le CEST/CPMG ont démontré leur efficacité dans la détection des échanges multi-états, le chemin qui mène des données brutes à la cinétique/thermodynamique est parsemé de défis à multiples facettes, allant du choix des modèles cinétiques potentiels à la charge de calcul. La pression, comme la température, constitue une variable thermodynamique fondamentale qui peut être utilisée pour moduler le paysage d'énergie libre des biomolécules, fournissant ainsi un outil pour étudier les fluctuations conformationnelles. En collaboration avec le Dr. E. Lescop (ICSN), le doctorant recueillera des données RMN à de multiples pressions (de 1 à 2500 bar) et températures (de 0 à 40°C) afin d'étudier les échanges conformationnels complexes de HSP90. La pression est un outil intéressant pour compléter les études plus classiques de température (loi d'Arrhenius). En collaboration avec son développeur (Dr. G. Bouvignies, ENS-Paris), nous utiliserons le logiciel ChemEx amélioré par l'IA pour analyser conjointement des ensembles de données CPMG et CEST enregistrées à des pressions et températures multiples. Une telle analyse combinée est avantageuse car elle permet de réduire le nombre de paramètres d'ajustement, ce qui rend les calculs plus robustes. Le doctorant utilisera la stratégie décrite ci-dessus pour caractériser la dynamique conformationnelle du domaine de liaison à l'ATP de HSP90 à une résolution atomique, à l'état libre et lié à différents ligands. On sait que HSP90 subit des réarrangements conformationnels massifs tout au long de son cycle fonctionnel. Des expériences préliminaires de RMN ont montré que le domaine de liaison à l'ATP présente au moins trois états faiblement peuplés. Le doctorant utilisera les stratégies CEST/CPMG à différentes températures et pressions pour déchiffrer comment ces ligands modulent le paysage énergétique de la chaperonne humaine HSP90. Ce projet vise essentiellement à mettre au point des méthodes quantitatives pour caractériser les équilibres conformationnels complexes échantillonnés par les protéines en solution. De tels développements sont essentiels si nous voulons acquérir une véritable représentation statistico-mécanique du paysage énergétique potentiel intrinsèque à HSP90. La caractérisation des différents conformères échantillonnés par HSP90 et la façon dont le ligand peut moduler le paysage énergétique seront particulièrement utiles pour la conception de nouveaux médicaments capables de bloquer la protéine dans un état donné, une étape importante vers le développement de médicaments plus spécifiques.

HSP90 is an essential protein in maintaining the folding of numerous human proteins. It is especially involved in the folding of numerous oncogenic proteins, and high levels of expression have been linked to the proliferation of tumors. This complex molecular machinery is known to undergo massive conformational rearrangements throughout its functional cycle. X-ray crystallography and cryoEM have provided high resolution snapshot structures of this human machinery in complex with cochaperones and client proteins but have failed to provide the kinetic and time-resolved information needed for a full understanding of its mechanism. Thus, there is a pressing need to encompass not only the native ground-state conformations of HSP90, but also all other conformers in exchange with it. However, this endeavor is complex, as many of these conformers are only transiently populated (less than a few percent of the total population/time), often escaping detection by standard biophysical and structural techniques. Over the past decade and a half, NMR spectroscopy has evolved into a powerful tool for characterizing dynamics and sparsely populated protein states at an atomic resolution. Central to the success of NMR in this context has been the development of chemical exchange-based experiments, such as Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) relaxation dispersion and chemical exchange saturation transfer (CEST). When paired with advanced computational tools, these experiments enable the extraction of kinetic parameters, thermodynamic attributes, and structural data pertaining to these elusive states. However, despite significant progress in this field, challenges remain, especially when the exchange processes involve more than two conformational states. While techniques like CEST/CPMG have demonstrated their efficacy in detecting multi-state exchanges, the pathway from raw data to kinetics/thermodynamics is strewn with multifaceted challenges, ranging from the choice of potential kinetic models to computational burdens. Pressure, like temperature, constitutes a fundamental thermodynamic variable that can be used to modulate the free energy landscape of biomolecules, thereby providing a probe to study conformational fluctuations. In collaboration with Dr. E. Lescop (ICSN), the PhD student will collect NMR data at multiple pressures (from 1 to 2500 bar) and temperatures (from 0 to 40°C) to probe complex conformational exchanges of HSP90. Pressure offers an attractive tool to complement the more classical temperature studies (Arrhenius law). In collaboration with its developer (Dr. G. Bouvignies, ENS-Paris), we will use AI-Enhanced ChemEx software to jointly analyze CPMG and CEST datasets recorded at multiple pressures and temperatures. Such combined analysis is advantageous as it allows reducing the number of fitting parameters, making the calculations more robust. The PhD student will use the strategy describe above to characterize the conformational dynamics of the ATP -binding domain of HSP90 at atomic resolution, in its free state and bound to different ligands. HSP90 is known to experience massive conformational rearrangement along its functional cycle. Preliminary NMR experiments have shown that the ATP-binding domain populates three or more weakly populated states. The PhD student will use the CEST/CPMG strategy at different temperatures and pressures to decipher how these ligands modulate the energy landscape of the human chaperone HSP90. In essence, this project aims to pioneer quantitative methods to characterize complex conformational equilibria sampled by protein in solution. Such developments are essential if we are to acquire a true statistical-mechanical representation of the potential energy landscape intrinsic to the dynamic HSP90 chaperone. Characterizing the different conformers sampled by HSP90 and how the ligand can modulate the energy landscape will be particularly useful for the design of new drugs capable of blocking the chaperone in a given state, an important step towards the development of more specific drugs.