Visant à mieux comprendre la myopie syndromique élevée en étudianttroubles héréditaires de la rétine avec un accent sur le rôle deprotéine 2b liée au récepteur des lipoprotéines (LRP2B)

Aiming to better understand syndromic high myopia by studinginherited retinal disorders with a focus on the role oflipoprotein receptor related protein 2b (LRP2B)

• Auteur / Autrice : Filip Spanic
• Direction : Christina Zeitz
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Inscription en doctorat le 01/03/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : Physiologie, physiopathologie et thérapeutique
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la Vision
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Identification of gene defects leading to non-progressive and progressive ocular diseases

Mots clés

Mots clés libres

Myopie

Récepteur de lipoprotéines

Rétine

Myopia

Lipoprotein receptor

Retina

Résumé

La myopie, une condition oculaire prévalente à l'échelle mondiale, est caractérisée par une augmentation anormale de la longueur axiale de l'œil pendant le développement réfractif. Elle peut être catégorisée en fonction de l'erreur réfractive du patient en tant que myopie légère (≤ -0,5 D) ou myopie sévère (≤ -6,00 D). La prévalence croissante de la myopie est une source de préoccupation. La myopie sévère est l'une des principales causes de cécité et peut également conduire à d'autres maladies oculaires telles que le glaucome, le décollement de la rétine et la cataracte. La myopie survient dans la cécité nocturne congénitale complète stationnaire (cCSNB), observable chez les humains et les modèles animaux montrant un défaut dans la transmission du signal ON-BC. De plus, elle est liée à la myopie sévère, en faisant un modèle précieux pour étudier les gènes et mécanismes associés à la myopie. Bien que les origines moléculaires de la cécité nocturne soient bien définies, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour clarifier les mécanismes impliqués dans le développement de la myopie chez les individus atteints de cécité nocturne congénitale complète stationnaire (cCSNB). Pour atteindre cet objectif, mon équipe d'accueil a accès à des modèles murins avec cCSNB (Gpr179 -/-, Lrit3 -/- et Grm6 -/-). Des séquençages transcriptomiques complets (ARN-Seq) sur trois modèles murins adultes distincts présentant une cCSNB, ainsi que leurs homologues appariés en âge (chaque groupe, n = 5), ont déjà été réalisés. Un des gènes différentiellement exprimés identifiés était LRP2BP. Ce gène code la protéine LRP2 binding protein (LRP2BP), localisée dans de gros terminaux axonaux bulbeux de cellules bipolaires de la rétine (RBC). Outre la rétine, la protéine de liaison LRP2 est fortement exprimée dans le cerveau, tandis qu'une expression plus faible est notée dans le système respiratoire, la peau, les tissus musculaires et les organes reproducteurs. Sa fonction implique la liaison et le recrutement de protéines au récepteur mégaline (LRP2), participant à l'endocytose et à la transduction du signal. De manière intéressante, des mutations dans LRP2 provoquent le syndrome de Donnai-Barrow/Facio-Oculo-Acoustico-Rénal, partiellement caractérisé par une myopie sévère, tandis que d'autres études suggèrent que LRP2 est nécessaire pour la croissance normale de l'œil. De plus, LRP2BP est situé sur le chromosome 4q35.1, une région supprimée chez les cas de myopie sévère. Pour explorer la fonction de LRP2BP dans la rétine, nous utiliserons des souris Lrp2bp-/- disponibles commercialement (janvier). À réception du modèle murin, nos premières étapes consisteront à valider son génotype et son phénotype. Pour l'évaluation du phénotype, nous utiliserons la tomographie par cohérence optique en domaine spectral (SD-OCT) pour examiner les caractéristiques structurelles de la rétine. La caractérisation fonctionnelle se fera par le biais de tests optomoteurs standard, de réfractométrie et d'électrorétinographie, des méthodes établies pour évaluer la vision. Nous prévoyons de caractériser l'expression cellulaire et la localisation de LRP2BP dans la rétine humaine et murine. De plus, nous avons l'intention d'étudier comment cette expression évolue au cours de différentes périodes de développement, en utilisant des techniques telles que l'hybridation in situ d'ARN, la RT-qPCR, l'immunolocalisation et les analyses par immunoblot. Pour explorer l'impact potentiel de la lumière sur l'expression de Lrp2bp, nous mesurerons son expression aux niveaux d'ARN et de protéines. Cette analyse sera réalisée sur des coupes de tissu rétinien obtenues à partir de souris sauvages préparées dans des conditions scotopiques (adaptation à l'obscurité) et photopiques (50 lux). Nous proposons plusieurs approches pour élucider l'implication de la dysrégulation de LRP2BP dans la myopie, comme démontré précédemment. En induisant la myopie chez les souris Lrp2bp-/- et Lrp2bp+/+ à l'aide de lentilles négatives, notre objectif est de quantifier le déplacement interoculaire moyen en utilisant la réfractométrie. Cette approche renforcera notre hypothèse selon laquelle les souris Lrp2bp-/- présentent une susceptibilité accrue à l'induction de la myopie. De plus, nous prévoyons d'explorer la relation entre LRP2BP et la signalisation modulatrice de la dopamine dans la rétine. Cette investigation comprend la mesure des niveaux de dopamine et de son métabolite, l'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC), à l'aide de la chromatographie liquide à ultra-performance (UPLC). Nous anticipons l'observation de niveaux de dopamine plus bas chez les souris Lrp2bp-/-, en accord avec les observations dans d'autres modèles murins de myopie. Cette découverte contribuera à établir une corrélation entre LRP2BP et la modulation de la dopamine rétinienne. Nous avons l'intention de réaliser le génotypage d'échantillons de patients myopes à l'aide de la PCR et du séquençage complet du génome pour identifier les défauts génétiques connus et nouveaux sous-jacents à la myopie. À travers nos expériences planifiées, nous visons à apporter de nouvelles perspectives sur la myopie syndromique et à élucider l'expression cellulaire et la localisation de LRP2BP dans la rétine. De plus, nous anticipons une meilleure compréhension du rôle du gène LRP2BP dans le développement de la myopie. En fin de compte, notre objectif est d'identifier de nouveaux gènes associés à la myopie, jetant les bases pour des expériences futures.

Myopia, a prevalent ocular condition globally, is characterized by an abnormal increase in the eye's axial length during refractive development. It can be categorized based on the patient's refractive error as low myopia (≤ -0.5 D) or high myopia (≤ -6.00 D). The increasing prevalence of myopia is a cause for concern. High myopia is one of the leading causes of blindness and can also lead to other ocular diseases such as glaucoma, retinal detachment, and cataract. Myopia occurs in complete congenital stationary night blindness (cCSNB), which can be observed in both humans and animal models showing a defect in ON-BC signal transmission. Additionally, it is linked to high myopia, making it a valuable model for investigating genes and mechanisms associated with myopia. While the molecular origins of night blindness are well-defined, there is a need for further research to clarify the mechanisms involved in the development of myopia in individuals with congenital stationary night blindness (cCSNB). To achieve this objective, my host team has access to mouse models with cCSNB (Gpr179 -/-, Lrit3 -/-, and Grm6 -/-). Whole transcriptome sequencing (RNA-Seq) on three distinct adult mouse models exhibiting cCSNB along with their corresponding age-matched littermates (each group, n = 5) was previously conducted. One of the identified DEGs was LRP2BP. This gene encodes low-density lipoprotein receptor-related protein 2b (LRP2BP). This protein was found to be localized in large bulbous axon terminals of rod BCs (RBCs). Besides the retina, the LRP2 binding protein is highly expressed in the brain, while lower expression is noted in the respiratory system, skin, muscle tissue, and reproductive organs. Its function involves binding and recruiting proteins to the megalin receptor (LRP2), which participates in endocytosis and signal transduction. Interestingly, mutations in LRP2 cause the Donnai-Barrow/Facio-Oculo-Acoustico-Renal syndrome, which is partially characterized by high-grade myopia, while other studies suggested that LRP2 is required for normal eye growth. Furthermore, LRP2BP is located on chromosome 4q35.1, a region deleted in cases with high myopia. To explore the function of LRP2BP in the retina, we will utilize commercially available Lrp2bp-/- mice (January). Upon receipt of the mouse model, our initial steps will involve validating its genotype and phenotype. For phenotype assessment, we will use spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) to examine the structural characteristics of the retina. Functional characterization will be conducted through standard optomotor tests, refractometry, and electroretinography, which are established methods for evaluating eyesight. We plan to characterize the cellular expression and localization of LRP2BP in the human and mouse retina. Additionally, we aim to investigate how this expression changes during different developmental periods, utilizing techniques such as RNA in situ hybridization, RT-qPCR, immunolocalization, and western blot analyses. To explore the potential impact of light on the expression of Lrp2bp, we will measure its expression at both RNA and protein levels. This analysis will be conducted on retinal tissue sections obtained from wild-type mice prepared under scotopic (dark adaptation) and photopic (50 lux) conditions. We propose multiple approaches to elucidate the involvement of LRP2BP dysregulation in myopia, as demonstrated previously. By inducing myopia in both Lrp2bp-/- and Lrp2bp+/+ mice through the application of negative spectacle lenses, our goal is to quantify the mean interocular shift using refractometry. This approach will strengthen our hypothesis that Lrp2bp-/- mice exhibit an increased susceptibility to myopia induction. Furthermore, we plan to explore the relationship between LRP2BP and dopamine modulatory signaling in the retina. This investigation includes measuring levels of dopamine and its metabolite, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), using ultra-performance liquid chromatography (UPLC). We anticipate observing lower dopamine levels in Lrp2bp-/- mice, aligning with observations in other myopia mouse models. This finding will contribute to establishing a correlation between LRP2BP and retinal dopamine modulation. We intend to perform genotyping of myopia patient samples using PCR and whole-genome sequencing to identify both known and novel gene defects underlying myopia. Through our planned experiments, we aim to offer new insights into syndromic myopia and elucidate the cellular expression and localization of LRP2BP in the retina. Additionally, we anticipate gaining a better understanding of the role of the LRP2BP gene in myopia development. Ultimately, our goal is to identify new genes associated with myopia, laying the foundation for future experiments.