Métabolomique et génomique fonctionnelle des mécanismes d'halogénation chez les algues brunes

Metabolomics and functional genomics of halogenation mechanisms in brown algae

• Auteur / Autrice : Eurydice Peti-jean
• Direction : Catherine Leblanc, Soizic Prado
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie des produits naturels
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences de la nature et de l'Homme : évolution et écologie
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie intégrative des modèles marins
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biologie des algues et interactions avec l'environnement

Mots clés

Mots clés libres

Métabolomique

Génomique fonctionnelle

VHPOs

Halogénation

Ectocarpus siliculosus

Metabolomics

Functional genomics

VHPOs

Halogenation

Ectocarpus siliculosus

Résumé

Le métabolisme halogéné jouerait un rôle unique dans la biologie des macroalgues, mais les voies de biosynthèse, la nature chimique et les rôles biologiques des composés halogénés in vivo sont très peu décrits. Le projet HALOGENE s'intéresse à l'évolution et au rôle de ce métabolisme chez les algues brunes, via l'étude d'enzymes clés de l'halogénation. Parmi ces enzymes, les haloperoxydases dépendantes du vanadium (vHPOs) ont été découvertes il y a plus de trente ans chez une algue brune et forment de grandes familles multigéniques dans cette lignée eucaryotique (1). Les vHPO catalysent l'oxydation d'halogénures en présence de peroxyde d'hydrogène pour produire un intermédiaire réactif, qui peut halogéner divers substrats organiques. Elles pourraient intervenir dans la détoxification oxydative, le renforcement de la paroi cellulaire et la production de composés halogénés dans des contextes de défense abiotique et biotique (2). Cependant, les substrats physiologiques des vHPOs n'ont pas été identifiés, et leur rôle biologique reste à valider chez les algues brunes. Cette thèse aura pour objectif d'étudier le rôle biochimique des vHPOs et décrypter les voies de biosynthèse des composés halogénés chez une algue brune modèle, Ectocarpus siliculosus, en couplant des approches de génomique fonctionnelle et de métabolomique. La mise au point récente d'un protocole permettant d'éteindre l'expression de gènes cibles par la méthode CRISPR-Cas9 (3) a permis de générer plusieurs mutants knock-outs (KO) du gène vHPO chez Ectocarpus. Au travers de l'étude de ces mutants et de la comparaison avec la souche sauvage, ce projet de thèse analysera la contribution de cette enzyme au métabolisme halogéné général. Une première étape consistera à valider la perte de l'activité protéique à partir d'extraits bruts de protéines, puis d'optimiser les conditions d'extractions chimiques et les méthodes d'analyses par spectrométrie de masse (LC-MS) du métabolome halogéné (4). Les profils métabolomiques des différentes souches seront comparés, suite à leur culture en laboratoire dans des conditions standards ou suite à l'application d'un stress oxydant. Les métabolites halogénés seront détectés grâce à leur massif isotopique par des outils type Haloseeker, caractérisés à l'aide d'approches de type réseaux moléculaires et en utilisant les bases de données de produits naturels et des bases de données internes. Leur biosynthèse in vitro sera aussi explorée à partir de substrats commerciaux incubés avec des extraits protéiques d'algues. Des analyses transcriptomiques seront également menées sur les différentes souches en culture, et la combinaison des données métabolomiques et transcriptomiques servira à déchiffrer les principales voies métaboliques liées au métabolisme halogéné.

The halogen metabolism is thought to play a unique role in the biology of macroalgae, but the biosynthetic pathways, the chemical nature and the biological roles of halogenated compounds in vivo are poorly described. The HALOGENE project is interested in the evolution and role of this metabolism in brown algae, through the study of key halogenating enzymes. These enzymes include vanadium-dependent haloperoxidases (vHPOs) which were discovered more than thirty years ago in a brown alga and form large multigenic families in this eukaryotic lineage (1). vHPOs catalyse the oxidation of halides in the presence of hydrogen peroxide to produce a reactive intermediate, which can halogenate various substrates. They could be involved in oxidative detoxification, cell wall reinforcement and the production of halogenated compounds during abiotic and biotic defence responses (2). However, the physiological substrates for vHPOs have not been identified, and their biological role has yet to be validated in brown algae. This PhD research project aims at studying the biochemical role of vHPOs and at deciphering the biosynthetic pathways of halogenated compounds in a model brown alga, Ectocarpus siliculosus, by combining functional genomics and metabolomics approaches. A recently developed protocol for switching off the expression of target genes using the CRISPR-Cas9 method (3) has generated several knock-out (KO) mutants of the vHPO gene in Ectocarpus. By studying these mutants and by comparing them with wild-type strains, this thesis project will analyse the contribution of this enzyme to halogenation processes in this brown alga species. The first step will be to validate the loss of protein activity using crude protein extracts, and then to optimise the chemical extraction conditions and analysis methods for profiling the whole halogenated metabolome by mass spectrometry (LC-MS) (4). The metabolomic profiles of the different strains will be compared, in laboratory cultures under standard conditions or submitting to oxidative stress. Halogenated metabolites will be detected thanks to their isotopic mass using Haloseeker-type tools, annotated and characterised using molecular network-type approaches and using natural product and internal databases. Their biosynthesis will be further explored in vitro by incubating putative substrates, commercially available, with algal protein extracts. Transcriptomic analyses will also be carried out on the different strains in culture, and the combination of metabolomic and transcriptomic data will be used to decipher the main metabolic pathways linked to halogen metabolism.