Etude des interactions cellule-matrice dans des géométries complexes générées par photopolymérisation biphotonique

Study of cell-matrix interactions in complex geometries generated by two-photon photopolymerization

• Auteur / Autrice : Pierre Ucla
• Direction : Sylvie Coscoy, Vincent Semetey
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 11/10/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : Physiologie, physiopathologie et thérapeutique
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Physico-Chimie Curie
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Physico-biologie aux méso-échelles
• Jury : Président / Présidente : Olivia Du roure
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvie Coscoy, Karine Anselme, Hans Van oosterwyck, François Amblard, Martin Bastmeyer, Vincent Semetey
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Karine Anselme, Hans Van oosterwyck

Mots clés

Mots clés libres

Microfabrication

Dynamique de l'actine

Angiogenèse

Photopolymérisation

Forces cellulaires

Micromécanique

Microfabrication

Actin Dynamics

Angiogenesis

Photopolymerization

Cellular forces

Micromechanics

Résumé

Les cellules peuvent percevoir et répondre aux signaux physiques de leur microenvironnement, notamment la topographie et la mécanique du substrat avec lequel elles sont en contact. Cela influence le comportement cellulaire, y compris la prolifération, la différenciation et la migration. La génération de forces est cruciale pour que les cellules sondent la mécanique locale et y répondent en conséquence. Cependant, mesurer les forces cellulaires dans des environnements 3D reste une tâche difficile. Dans ce manuscrit, j'ai commencé par passer en revue la topographie et la mécanique de l'environnement cellulaire physiologique, avant de présenter certaines des méthodes les plus couramment utilisées pour mesurer les forces cellulaires dans un contexte in vitro, ainsi que leurs limitations. J'introduis également la polymérisation à deux photons comme une méthode de microfabrication prometteuse pour créer des environnements cellulaires synthétiques avec des propriétés physiques contrôlées. L'objectif principal de ma thèse a été de développer une technique de mesure des forces en 3D reposant sur le développement de réseaux déformables de fibres microfabriquées. Des réseaux imitant un environnement fibrillaire 3D ont été développés et des résines photosensibles ont été choisies pour maximiser l'adhésion cellulaire aux fibres tout en minimisant l'adhésion aux structures de support. Les fibres, construites sous forme de lignes de voxel, présentaient des propriétés mécaniques et géométriques variées que j'ai caractérisées à l'aide de la microscopie à force atomique (AFM). Des mesures de nanoindentation ont été effectuées pour estimer le module de Young des fibres, tandis que les expériences de déflexion AFM sur des fibres suspendues ont indiqué que la tension induite durant le développement contribuait de manière prédominante à la rigidité des fibres dans les expériences cellulaires. J'ai développé une méthode reposant sur la segmentation 3D des fibres défléchies ainsi que sur la modélisation par éléments finis pour mesurer les forces exercées par les cellules dans le système, produisant une carte des forces de traction indiquant l'intensité des forces locales au niveau des fibres individuelles. La méthode a été validée sur plusieurs lignées cellulaires, y compris les cellules endothéliales HUVECs et les fibroblastes NIH/3T3 qui exercent des forces de traction importantes, ainsi que les macrophages murins et les cellules dendritiques exerçant de plus faibles forces. Nos mesures ont montré des variations de force locales et globales en fonction de la mécanique (rigidité) et de la topographie (densité des fibres). Dans une étude distincte, je me suis concentré sur l'influence de la topographie sur la formation des protrusions endothéliales et l'engagement vertical des cellules dans des réseaux photopolymérisés. J'ai développé une routine d'analyse d'image automatisée utilisant des réseaux de neurones convolutifs (CNN) qui a permis d'étudier la dynamique des filopodes. Leurs caractéristiques clés telles que la longueur, la durée de vie ou la densité ont été quantifiées en réponse à des traitements pharmacologiques. L'étude a identifié le rôle de la voie de la kinase de la chaîne légère de myosine (MLCK) dans les transitions entre les états protrusifs. L'induction de filopodes endothéliaux, rappelant les premières étapes de l'angiogenèse, était indépendante de la voie classique du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), suggérant un rôle potentiel des signaux topographiques dans des voies alternatives de l'angiogenèse.

Cells can sense and respond to physical cues from their microenvironment, notably the topography and mechanics of the substrate they contact. This influences cell behavior, including proliferation, differentiation, and migration. Force generation is crucial for cells to probe local mechanics and respond accordingly. However, measuring cell forces in 3D environments is still a challenging task. In this manuscript, I started by reviewing the topography and mechanics of the physiological cellular environment, before presenting some of the prominent methods used to measure cellular forces in an in vitro context, along with their limitations. I also highlighted Two-Photon Polymerization (TPP) as a promising microfabrication method for creating synthetic cellular environments with controlled physical properties. The main focus of my thesis was put on the development of a 3D force measurement technique relying on the development of deformable arrays of photopolymerized fibers using TPP. Microscaffolds mimicking a fibrillar 3D environment were developed and photosensitive resins were chosen to maximize cell adhesion to the fibers while minimizing adhesion to support structures. The fibers, constructed as single voxel lines, had varied mechanical and geometrical properties that I characterized using Atomic Force Microscopy (AFM). Nanoindentation measurements were performed to estimate the Young's modulus of the fibers while AFM deflection experiments on suspended fibers indicated that shrinkage-induced tension largely contributed to fiber stiffness in cell experiments. A pipeline relying on 3D segmentation of deflected fibers along with Finite Element Modeling was developed to measure the forces exerted by cells in the system, producing a traction force map indicating local force intensity at the level of individual fibers. The method was validated on several cell lines, including high traction force-exerting endothelial HUVECs and fibroblasts NIH/3T3, and lower force-exerting murine macrophages and dendritic cells. Our measurements demonstrated local and global force variations based on mechanics (stiffness) and topography (fiber density). In a distinct study, I focused on the influence of topography on endothelial protrusion formation and vertical cell engagement in photopolymerized microscaffolds. I developed an automated image analysis pipeline using Convolutional Neural Networks (CNN) that allowed to investigate filopodia dynamics. Key features like length, lifetime or density were quantified, showing variations in response to pharmacological treatments. The study identified the role of the Myosin Light Chain Kinase (MLCK) pathway in transitions between protrusive states. The induction of endothelial filopodia, reminiscent of early angiogenesis steps, was independent of the classical Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) pathway, suggesting a potential role for topographical cues in alternative angiogenesis pathways.