Etude de la plasticité du complexe NucS-PCNA-MM_DNA

Study of the plasticity of the NucS-PCNA-MM_DNA complex in archaea.

• Auteur / Autrice : Elina Raya
• Direction : Mirjam Czjzek
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie des organismes
• Date : Inscription en doctorat le 01/01/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences de la nature et de l'Homme : évolution et écologie
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie intégrative des modèles marins
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Glycobiologie Marine

Mots clés

Mots clés libres

Complexe NucS-PCNA-DNA MM

Mésappariements d'ADN

Archées

Voie de réparation d'ADN non canonique; indépendante d'ATP

Recombinaison homologue

Cassure double brin d'ADN

NucS-PCNA-DNA MM complex

DNA mismatch

Archaea

Non canonical ATP- independent DNA repair pathway

Homologous recombination

Double stranded DNA break

Résumé

L'ADN subit des discordances au cours de divers processus, tels que la formation d'hétéroduplex lors de la recombinaison homologue (HR), la réplication de l'ADN et l'exposition à l'ionisation et aux mutagènes chimiques. Ces discordances jouent un rôle crucial dans la génération de la diversité génétique, facilitant l'adaptation et la spécification des traits dans les populations microbiennes. La voie de réparation MMR sert de sauvegarde contre la transmission de ces mutations et constitue un mécanisme conservé que l'on retrouve dans de nombreuses espèces, y compris les humains et les bactéries. Cette voie implique de multiples protéines, MutS se liant à la discordance de l'ADN en présence d'ATP, conduisant au recrutement du complexe nucléase MutSL. Ce complexe est essentiel pour exciser le(s) nucléotide(s) discordant(s). Chez les humains, le chargement du complexe nucléase MutSL est facilité par la pince PCNA. Des études bioinformatiques antérieures dans de nombreux génomes archéens et bactériens n'ont pas réussi à identifier les gènes de réparation MMR canoniques mutSL. Ces observations ont conduit à la découverte d'une endonucléase spécifique des discordances non canoniques, NucS, présente chez les actinobactéries et les archées. Les recherches sur cette voie n'ont révélé aucune similitude de séquence ou de structure avec les protéines MMR et ont souligné son mode d'action indépendant de l'ATP, provoquant une coupure de l'ADN double brin au site de la discordance. De manière intrigante, l'inactivation génétique de NucS a entraîné une augmentation des niveaux de mutation et de recombinaison entre des séquences d'ADN étroitement liées mais non identiques. Malgré l'absence de similitudes apparentes entre les deux voies, nos études ont démontré le rôle essentiel de la formation du complexe évolutivement conservé NucS- pince de réplication (PCNA, -clamp) dans l'évitement des mutations. Pour élucider la fonction précise de NucS en tant qu'anti-recombinase et comprendre l'interaction entre MMR et la recombinaison, nous souhaitons aborder plusieurs questions clés, l'une d'entre elles (No. 4) étant le focus du travail de thèse : 1- Comment la réparation des cassures double brin créées par NucS est-elle liée à d'autres processus cellulaires ? 2- Est-il possible d'avoir une MMR dépendante de la recombinaison sans discrimination des brins ? 3- Quelles sont les caractéristiques biochimiques de l'activité anti-recombinase de NucS ? 4- Quel est le rôle fonctionnel de la plasticité structurale du complexe tripartite NucS-PCNA-MM ADN ? Pour répondre à ces interrogations, le travail du projet est organisé en plusieurs tâches et celle concernant le travail de thèse apportera des informations détaillées sur la dynamique du complexe protéique aux premiers stades de la reconnaissance des discordances. La tâche concernant le travail consiste à approfondir la caractérisation biochimique, biophysique et structurale du complexe ternaire : NucS:PCNA:ADN-MM. Ces investigations se concentreront sur les premiers stades de la reconnaissance des discordances par le complexe NucS-PCNA, avec une masse moléculaire attendue d'environ 162 kDa. Des criblages systématiques pour la formation de ces complexes seront réalisés en manipulant la stœchiométrie, la longueur et la composition de l'ADN-MM, en incorporant une discordance préférentielle ''GT''. Ces études seront spécifiquement menées sur des souches inactivées de NucS pour éviter la dégradation des substrats et faciliter la capture des complexes enzyme-substrat. Plus précisément, l'objectif de cette tâche est d'obtenir des informations structurales haute résolution sur le complexe ternaire NucS et de comprendre de manière dynamique le complexe ternaire NucS avec des substrats linéaires et/ou de ''recombinaison''. Pour ce faire, nous menons une analyse quantitative du complexe ternaire NucS en utilisant des méthodes biochimiques et biophysiques complémentaires, notamment la chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (MALS-SEC), la centrifugation analytique ultracentrifuge, la calorimétrie isotherme, et la microscopie à force atomique. Ces méthodes permettent la détermination précise des affinités de liaison et de la stœchiométrie des différents composants. Pour une précision accrue, nous utilisons deux approches hautement complémentaires. La première consiste à étudier les cristaux de PabPCNA (6T7X) et PabNucS/EndoMS en utilisant la modélisation moléculaire et les simulations de dynamique moléculaire basées sur nos données existantes de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) pour dériver un modèle atomistique du complexe ternaire. La deuxième approche implique la cryo-microscopie électronique, réalisée à la fois sur place et à travers des installations françaises/européennes. Enfin, notre enquête plongera dans la voie ATP-indépendante dans des conditions proches du natif en utilisant des expériences de SAXS et de FRET. Cette approche vise à explorer l'ensemble des structures biomoléculaires et la courbure de l'ADN induite par le complexe, un facteur qui pourrait influencer la reconnaissance des discordances (MM). Les conditions optimisées pour la formation du complexe seront appliquées aux expériences de SAXS au synchrotron SOLEIL, spécifiquement à la ligne SWING. De plus, l'étude de la courbure de l'ADN au sein du complexe NucS/EndoMS-PCNA implique le FRET ou la classification 2D des images de Cryo microscopie électronique (cryo-EM).

DNA mismatches arise through various processes, including heteroduplex formation during homologous recombination (HR), DNA replication, and exposure to ionisation and chemical mutagens. These mismatches play a crucial role in generating genetic diversity, facilitating adaptation, and specifying traits in microbial populations. The MMR pathway serves as a safeguard against the transmission of these mutations and is a conserved mechanism found in many species, including humans and bacteria. The pathway involves multiple proteins, with MutS binding to the DNA mismatch in the presence of ATP, leading to the recruitment of the MutSL nuclease complex. This complex is essential for excising the mismatched nucleotide(s). In humans, the loading of the MutSL nuclease complex is facilitated by the PCNA clamp. Earlier bioinformatics investigations in many archaeal and bacterial genomes did not succeed in identifying the canonical MMR repair genes mutSL. These findings prompted the discovery of a non-canonical mismatch-specific endonuclease, NucS, in actinobacteria and archaea. Research on this pathway revealed no sequence or structural resemblance to MMR proteins and highlighted its ATP-independent mode of action, causing a double-stranded DNA break at the mismatch site. Intriguingly, the genetic inactivation of NucS led to elevated levels of mutation and recombination between closely related but non-identical DNA sequences. Despite lacking apparent similarities between the two pathways, our studies demonstrated the essential role of the formation of the evolutionarily conserved NucS-replication clamp (PCNA, -clamp) complex in mutation avoidance. To elucidate the precise function of NucS as an anti-recombinase and to comprehend the interplay between MMR and recombination, we intend to tackle several key questions, one of which (No. 4) is the focus of the thesis subject within this collaborative work: 1. How repair of DSBs created by NucS is coupled with other cellular processes? 2. Is the recombination‐dependent MMR without strand discrimination possible? 3. What are the biochemical characteristics of the NucS anti‐recombinase activity? 4. What is the functional role of the structural plasticity of the tripartite NucS ‐PCNA‐MM DNA complex? To address these inquiries, the project is divided into tasks, the one treated by the thesis work will provide detailed information on the protein complex dynamics of the early stages of MM recognition. The task which defines the thesis work involves delving into the biochemical, biophysical, and structural characterization of the ternary complex: NucS:PCNA:MM-DNA. These investigations will focus on the early stages of MM recognition by the NucS-PCNA complex, expecting a molecular mass of approximately 162 kDa. Systematic screenings for the formation of these complexes will be conducted by manipulating the stoichiometry, length, and composition of MM-DNA, incorporating a preferred ''GT'' mismatch. These studies will specifically be carried out on inactivated NucS strains to prevent substrate degradation and facilitate the capture of enzyme-substrate complexes. More specifically, the objective of this task is to acquire high-resolution structural information on the ternary NucS complex and to gain a dynamic understanding of the NucS ternary complex with linear and/or ''recombination'' substrates. To achieve this, we are conducting a quantitative analysis of the NucS ternary complex employing complementary biochemical and biophysical methods, including gel filtration (MALS-SEC), analytical ultracentrifugation, isothermal calorimetry, and atomic force microscopy. These methods will enable the precise determination of binding affinities and stoichiometry of the various components. For enhanced precision, we are employing two highly complementary approaches. The first involves studying crystals of PabPCNA (6T7X) and PabNucS/EndoMS using molecular modelling and molecular dynamics simulations based on our existing small-angle X-ray scattering (SAXS) data to derive an atomistic model of the ternary complex. The second approach entails cryo-electron microscopy, conducted both on-site and through French/European facilities. Finally, our investigation will delve into the ATP-independent pathway under near-native conditions through the utilisation of SAXS and FRET experiments. This approach aims to explore the ensemble of biomolecular structures and the complex-induced DNA bending, a factor that could potentially influence mismatch (MM) recognition. The conditions optimised for complex formation will be applied to SAXS experiments at the SOLEIL synchrotron, specifically at the SWING beamline. Additionally, the study of DNA bending within the NucS/EndoMS-PCNA complex will involve FRET or the 2-D classification of cryo-electron microscopy (cryo-EM) images.