Comprendre et cibler la molécule intracellulaire ''CISH'' dans les cellules Natural Killer: une stratégie pour optimiser les traitements en immunothérapies

Understanding and targeting the intracellular molecule ''CISH'' in Natural Killer cells: a strategy to optimize immunotherapy treatments

• Auteur / Autrice : Pierre-Louis Bernard
• Direction : Jacques Nunès
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Immunologie
• Date : Soutenance en 2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CRCM - Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : CRCM - E14 - Immunité et Cancer
• Jury : Président / Présidente : Alice Carrier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jacques Nunes, Anne Caignard, Véronique Braud, Antoine Marcais, Geoffrey Guittard
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Anne Caignard, Véronique Braud

Mots clés

Mots clés libres

Immunologie

Cancer

Signalisation intracellulaire

Immunology

Cancer

Intracellular signaling

Résumé

Les immunothérapies s’appuient sur les capacités antitumorales du système immunitaire. Les anticorps inhibiteurs de point de contrôle immunitaire [immune checkpoint inhibitors (ICI)] ont sensiblement amélioré le traitement de certains cancers (allongement de la survie, rémission). Les ICI ciblent préférentiellement des récepteurs inhibiteurs à la surface des lymphocytes cytotoxiques T CD8+. Ainsi désinhibés, ces lymphocytes retrouvent leur action antitumorale. Cependant, l’usage des ICI est encore limité (peu de patients éligibles, résistances), ce qui impose de compléter ces approches. D’une part, en étudiant d’autres types de lymphocytes cytotoxiques. D’autre part, en ciblant d’autres mécanismes régulant leur activité, en particulier dans un référentiel axé sur la signalisation Le laboratoire a montré précédemment que le ciblage de la protéine intracellulaire CISH ((Cytokine Inducible SH2 containing protein) potentialise l’élimination des cellules tumorales par les lymphocytes CD8+. Nous voulons étendre ce concept aux lymphocytes cytotoxiques Natural Killer (NK). Capables d’identifier un large spectre de cellules tumorales, sans pré-exposition préalable aux antigènes, les NK sont en première ligne dans la réponse antitumorale. Le projet s’articule en deux objectifs : 1) Etudier la réponse antitumorale NK dans un contexte CISH-KO, en nous focalisant sur la signalisation des récepteurs activateurs NK 2) Cartographier les réseaux d’interactions de CISH dans différentes voies de stimulation, dans les lymphocytes NK et les lymphocytes cytotoxiques en général Pour répondre à la première partie, nous avons généré un modèle murin dans lequel CISH est délété spécifiquement dans les cellules NK. Le KO n’a pas d’incidence sur le phénotype NK à l’état basal. En accord avec la littérature, les cellules NK CISH-KO sont plus sensibles à la stimulation par IL-2/IL-15. L’analyse transcriptomique des NK Cish-KO montre un enrichissement de voies associées au cycle cellulaire et à l'activation des NK. Nous montrons que CISH est induite en aval des stimulations par les récepteurs activateurs chargés de reconnaitre les cellules tumorales, et que son absence potentialise leurs voies de signalisation. Le ciblage spécifique de CISH dans les cellules NK est suffisant pour améliorer la réponse antitumorale in vitro et in vivo, dans des modèles métastatiques (B16F10, mélanome) et de tumeurs primaires (E0711, cancer du sein). Dans le modèle de tumeur primaire, les NK Cish-KO font preuve d’une meilleure infiltration, montrent une meilleure activité cytotoxique et expriment moins de marqueurs d’épuisement (TIGIT). Nous avons étendu notre concept aux cellules NK humaines (lignée NK-92 et NK primaires), en ciblant l’expression de CISH à l’aide de la technologie CRISPRi, et d’un nouveau vecteur lentiviral permettant un gain d’efficacité sensible dans la transduction des cellules NK. Nous montrons que CISH est aussi exprimé en aval des récepteurs activateurs NK dans les cellules humaines. La délétion de CISH favorise la signalisation NCR et les fonctions antitumorales dans les cellules NK humaines in vitro Ces résultats valident notre approche visant à cibler des freins intracellulaires dans les cellules NK pour potentialiser leur activité antitumorale. CISH pourrait à l’avenir être ciblée en clinique, notamment dans le contexte de thérapies adoptives. Pour le deuxième projet, nous nous sommes dotés d’un modèle murin innovant dans lequel la protéine CISH endogène a été remplacée par une version exprimant un tag OST, qui permet de faciliter les expériences de co-immunoprécipitation. L’identification des interacteurs de CISH est réalisée en spectrométrie de masse. Après une phase d’optimisation, nous décrivons un premier interactome de CISH obtenu dans les lymphocytes CD8+. La généralisation de cette approche doit nous permettre de comprendre plus finement la biologie de CISH et constitue une première étape vers le ciblage pharmacologique de CISH.

Immunotherapies are built on the anti-tumor capacities of the immune system. Immune checkpoint inhibitors (ICI) have significantly improved the treatment of certain cancers (longer survival, remission). Currently available ICIs preferentially target inhibitory receptors on the surface of cytotoxic CD8+ T lymphocytes, releasing the brake on their anti-tumor activity. However, the use of ICI is still limited (few eligible patients, resistance). Additional approaches are needed. First, by studying other types of cytotoxic lymphocytes. In addition, by targeting other mechanisms regulating their activity, in particular in a signaling framework. Our laboratory has previously shown that targeting the intracellular protein CISH (Cytokine Inducible SH2 containing protein) potentiates tumor cell elimination by CD8+ lymphocytes. We aim to extend this concept to Natural Killer (NK) cytotoxic lymphocytes. Able to identify a broad spectrum of tumor cells without prior antigen exposure, NKs are at the forefront of the anti-tumor response. The project has two objectives: 1) To investigate the NK antitumor response in a CISH-KO context, focusing on NK activating receptor signaling. 2) To map CISH interaction networks in different stimulation pathways, in NK lymphocytes and cytotoxic lymphocytes in general. To address the first part, we generated a mouse model in which CISH is specifically deleted in NK cells. The KO does not affect the basal NK phenotype. In agreement with the literature, CISH-KO NK cells are more sensitive to IL-2/IL-15 stimulation. Transcriptomic analysis of CISH-KO NKs shows enrichment of pathways associated with cell cycle and NK activation. We show that CISH is induced downstream of stimulation by activator receptors responsible for tumor cell recognition, and that its absence potentiates their signaling pathways. Specific targeting of CISH in NK cells is sufficient to enhance the antitumor response in vitro and in vivo, in metastatic (B16F10, melanoma) and primary tumor (E0711, breast cancer) models. In the primary tumor model, Cish-KO NK cells showed improved infiltration, enhanced cytotoxic activity and reduced expression of depletion markers (TIGIT). We have extended our concept to human NK cells (NK-92 and primary NK lineage), targeting CISH expression using CRISPRi technology, and a novel lentiviral vector allowing a significant gain in NK cell transduction efficiency. We show that CISH is also expressed downstream of activating NK receptors in human cells. CISH deletion promotes NCR signaling and antitumor functions in human NK cells in vitro. These results validate our approach aimed at targeting intracellular brakes in NK cells to potentiate their antitumor activity. CISH could in future be targeted in the clinic, notably in the context of adoptive therapies. For the second project, we have set up an innovative mouse model in which the endogenous CISH protein has been replaced by a version expressing an OST tag, facilitating co-immunoprecipitation experiments. CISH interactors are identified by mass spectrometry. After an optimization phase, we describe a first CISH interactome obtained in CD8+ lymphocytes. The generalization of this approach should enable us to understand the biology of CISH in greater detail, and is a first step towards pharmacological targeting of CISH.