Transitions de phase et formation d’amyloïdes par les protéines V et W des virus Nipah et Hendra

Phase transition and amyloid formation by V and W proteins of Nipah and Hendra viruses

• Auteur / Autrice : Giulia Pesce
• Direction : Sonia Longhi
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé: Biochimie structurale
• Date : Soutenance en 2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : AFMB - Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques
• Jury : Président / Présidente : Marianne Ilbert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sonia Longhi, Salvador Ventura, Stefano Ricagno, Cyrille Mathieu, Frédéric Iseni, Stefania Brocca
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Salvador Ventura, Stefano Ricagno

Mots clés

Mots clés libres

Transitions et séparations de phase

Amyloïdes

Virus Nipah

Virus Hendra

Phase transitions and separations

Amyloids

Nipah virus

Hendra virus

Résumé

Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) sont des pathogènes humains sévères appartenant au genre Henipavirus dans la famille des Paramyxoviridae. Au-delà de la protéine P, le gène P code également pour les protéines V et W qui partagent avec P leur domaine N-terminal intrinsèquement désordonné (NTD) et possèdent des domaines C-terminaux distincts (CTD). Les protéines V et W sont des acteurs clés dans l'évasion de la réponse immunitaire innée de l'hôte. Cette thèse porte sur les protéines V et W des Henipavirus et sur leurs domaines. La découverte que la protéine V du HeV subit une transition liquide-gel a servi de base à ce travail. Cette observation initiale a conduit à l'identification de la région PNT3 au sein du NTD de V en tant que région responsable de ce comportement. PNT3 s’est aussi avérée capable de former des fibrilles de type amyloïde in vitro, et un motif amyloïdogène critique contenant trois tyrosines consécutives (EYYY) a été identifié. Des expériences de coloration au Rouge Congo de cellules de mammifères transfectées pour exprimer V ou PNT3, ou infectées par HeV, ont suggéré que ces fibrilles pouvaient également se former dans un contexte cellulaire, suggérant un possible rôle dans la pathogenèse du HeV. Après avoir validé et étendu ces données préliminaires, nous avons étudié les déterminants moléculaires de la fibrillation de PNT3, en nous focalisant sur la contribution de chacune des trois tyrosines du motif amyloïdogène. En utilisant la mutagenèse dirigée, nous avons montré que chaque tyrosine a un impact significatif sur l'élongation des fibres. De plus, nous avons montré que la moitié C-terminale de PNT3 en empêche la fibrillation. Enfin, nous avons montré que la PNT3 du NiV forme également des fibrilles in vitro, bien que moins efficacement que celle du HeV. Nous avons ensuite utilisé la résonance paramagnétique électronique en marquage de spin pour étudier plus en détail les mécanismes de fibrillation de PNT3. Ces études ont révélé la persistance d'un haut degré de flexibilité au sein des fibrilles de PNT3 et l'absence de transition désordre-ordre. Ces résultats suggèrent que les fibrilles de PNT3 présentent une structure flexible et hétérogène, rappelant d'autres amyloïdes caractérisées par un « fuzzy coat » composé de régions désordonnées entourant un « core » fibrillaire central. Nous avons ensuite étendu nos recherches aux protéines W des Henipavirus, et avons montré qu’elles sont intrinsèquement désordonnées et capables de former des structures de type amyloïde tant in vitro que dans les cellules. En effet, des études par microscopie confocale et ultramicrotomie de cellules transfectées et exprimant la W du HeV ont révélé des macrostructures fibrillaires dans le noyau de ces cellules, soulignant l'importance potentielle de la fibrillation dans l'infection par l'Henipavirus. En combinant diverses approches biochimiques et biophysiques, nous avons montré que le CTD des protéines W est intrinsèquement désordonné et capable d'interagir avec le NTD, entrainant une transition désordre-ordre dans l’NTD et influençant positivement les capacités de fibrillation de ce dernier. Enfin, nous avons étendu ces études à un autre membre de la famille des Paramyxoviridae, le virus de la rougeole (MeV). Nos résultats ont révélé que si le NTD du MeV peut former des fibrilles, il le fait moins efficacement que les protéines des Henipavirus, suggérant la nécessité d'éléments supplémentaires pour promouvoir la fibrillation. Dans l'ensemble, cette thèse améliore notre compréhension des protéines V et W des Henipavirus et de leurs mécanismes de fibrillation, ouvrant de nouvelles voies de recherche visant à élucider l'importance fonctionnelle du processus de fibrillation chez les Paramyxoviridae.

Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses are severe human pathogens within the Henipavirus genus in the Paramixoviridae family. In addition to the P protein, their P gene also encodes the V and W proteins that share with P their N-terminal intrinsically disordered domain (NTD) and possess distinct C-terminal domains (CTDs). The V and W proteins are key players in the evasion of the antiviral host innate immune response. This thesis focuses on Henipavirus V and W proteins and their domains. The serendipitous previous discovery that the HeV V protein undergoes a liquid-to-gel transition, provided the basis for this work. This initial observation led to the identification of the PNT3 region within the NTD of HeV V (aa 200-310) as the region responsible for this behaviour. In addition, PNT3 was found to form amyloid-like fibrils in vitro, and a critical amyloidogenic motif involving three consecutive tyrosines (EYYY) was identified. Subsequent experiments of Congo Red staining of mammalian cells either transfected to express HeV V or PNT3, or infected with HeV suggested that such amyloid-like fibrils may form also in a cellular context, raising questions about their role in Henipavirus pathogenesis. After having carried out a series of experiments to validate and extend those preliminary data, we subsequently further investigated the molecular determinants of PNT3 fibrillation, focusing on the importance of each of the three contiguous tyrosines of the amyloidogenic motif. Using site-directed mutagenesis, we showed that each tyrosine has a significant impact on fibrillation mainly affecting the elongation phase. Additionally, the C-terminal half of PNT3 was shown to hinder fibrillation. Finally, we showed that NiV PNT3 is able to fibrillate in vitro, albeit to a lower extent than HeV, thus highlighting the preservation of the fibrillation abilities across Henipaviruses. We then used site-directed spin labeling coupled to Electron Paramagnetic Resonance to further investigate the mechanisms of PNT3 fibrillation. These studies revealed the persistence of a high degree of flexibility within PNT3 fibrils and the absence of a disorder-to-order transition during fibril formation. These findings suggest that PNT3 fibrils exhibit a flexible, heterogeneous structure, reminiscent of other amyloids characterized by a “fuzzy coat” made of disordered regions surrounding a central fibrillar core. The research was then extended to Henipavirus W proteins, which were shown to be intrinsically disordered. Furthermore, W proteins were found to be able to form amyloid-like structures both in vitro and in cellula. In fact, confocal microscopy and ultramicrotomy studies of cells transfected with a vector encoding HeV W revealed fibril-like macro-structures within the nucleus of these cells, emphasizing the potential significance of fibrillation in Henipavirus infection. By combining various biochemical and biophysical approaches, we showed that the CTD of the Henipavirus W proteins is intrinsically disordered and able to interact with the NTD, triggering a disorder-to-order transition within the NTD and positively influencing the fibrillation capabilities of the latter, highlighting the complex interplay between NTD and CTD in Henipavirus W proteins. Finally, we extended these studies to investigate another member of the Paramyxoviridae family, Measles virus (MeV). Our findings unveiled that while MeV NTD can form fibrils, it does so less efficiently than Henipavirus proteins, suggesting the need for additional elements to promote the fibrillation process. Collectively, this thesis enhances our understanding of Henipavirus V and W proteins and their fibrillation mechanisms, and opens new avenues for further research aimed at shedding light onto the functional significance of the fibrillation process in Paramyxoviridae.