Etude de mécanismes thiol-switch originaux impliqués dans l'adaptation à l'environnement chez Pseudomonas aeruginosa

Caracterization of two original thiol-switch mechanisms implicated in Pseudomonas aeruginosa adaptation to the environment

• Auteur / Autrice : Marie Grandjean
• Direction : Corinne Sebban Kreuzer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie structurale
• Date : Soutenance le 21/12/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Bleves
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Corinne Sebban Kreuzer, Sylvie Chevalier-Laurency, Christophe Beloin, Jean-François Collet, Christophe [Etienne Charles] Bordi
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sylvie Chevalier-Laurency, Christophe Beloin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Alginates

Pseudomonas aeruginosa

Homéostasie

Perception géographique

Biofilms

Oxydoréduction

Mots clés libres

Rédox

Tdor

Pseudomonas

Biofilm

Secretion

Redox

Tdor

Pseudomonas

Biofilm

Secretion

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste de l’Homme et un modèle d’étude pour ses capacités d’adaptation hors du commun, qu’elle doit à ses multiples systèmes de perception du stress et de reprogrammation de l’expression génétique. Pendant ma thèse, je me suis particulièrement intéressée aux mécanismes de perception de l’environnement chez P. aeruginosa via des protéines à cystéines présentant des mécanismes thiol-switch, et aux protéines de la famille des Thiol-disulfure oxydoréductases (TDORs), qui régulent ces mécanismes par leur activité catalytique. Ces mécanismes moléculaires impliquent des cycles d’activation / inactivation de protéines de fonctions variées dépendant de l’état d’oxydation de cystéines réactives, et constituent des régulations post-traductionnelles rapides, réversibles et sensibles aux modifications de l’homéostasie redox intracellulaires.Dans le cadre de mon premier projet de thèse (Chapitre I), nous avons cherché à identifier de nouveaux mécanismes thiol-switch en recherchant les substrats d’une TDOR cytoplasmique atypique identifiée dans le génome de P. aeruginosa. Nous avons mis en évidence que Patrx2 présente une activité et un état rédox paradoxal pour une TDOR cytoplasmique, semblable aux TDORs périplasmiques catalysant la formation de ponts disulfures structuraux. Nous avons déterminé que patrx2 est exprimée via le sigma facteur extracytoplasmique AlgU chez des souches mucoïdes de P. aeruginosa surproduisant un biofilm d’alginate, et avons montré que des mutants Δpatrx2 présentent un défaut de production d’alginate. Nous avons mis en évidence que AlgA, une enzyme cytoplasmique impliquée dans la synthèse des précurseurs de l’alginate, est un substrat potentiel de Patrx2. Ces résultats nous ont permis de proposer un nouveau mécanisme de régulation rédox de la biosynthèse de l’alginate impliquant la formation d’un pont disulfure catalysé dans le cytoplasme par une TDOR paradoxale.Dans mon second projet de thèse (Chapitre II), nous avons étudié le rôle d’un pont disulfure identifié dans la structure d’un effecteur sécrété via le système de sécrétion de type VI H1 de P. aeruginosa. Ces effecteurs étant injectés directement depuis le cytoplasme d’une bactérie prédatrice dans le périplasme d’une bactérie proie sans passer par une étape de maturation dans le cytoplasme, ils ne présentent généralement pas de ponts disulfures structuraux. Nous avons mis en évidence que ce pont disulfure n’impacte ni l’activité amidase de cette enzyme ni sa stabilité, et qu’il semble être impliqué dans le désassemblage de l’effecteur avec les protéines de la machinerie une fois sécrété. Nos résultats nous permettent de proposer un nouveau mécanisme de désassemblage d’un effecteur du H1-SSTVI avec les protéines de la machinerie via la formation d’un pont disulfure.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen and a remarkable adaptability due to multiple stress perception systems. During my PhD, I focused on environmental perception in P. aeruginosa implicating cysteine proteins with thiol-switch mechanisms and on proteins of the thiol disulfide oxidoreductase (TDOR) family that regulate these mechanisms through their catalytic activity. These molecular mechanisms involve activation/inactivation cycles of proteins with different functions depending on the oxidation state of reactive cysteines, and rapid, reversible posttranslational regulations that respond to changes in intracellular redox homeostasis.In my first project (Chapter I), we sought to identify novel thiol-switch mechanisms by searching for the substrates of an atypical cytoplasmic TDOR identified in the genome of P. aeruginosa. We demonstrated that Patrx2 exhibits a paradoxical activity and redox state for a cytoplasmic TDOR, and similar to periplasmic TDORs that catalyze the formation of structural disulfide bridges. We found that patrx2 is expressed via the extracytoplasmic sigma factor AlgU in mucoid strains of P. aeruginosa that overproduce an alginate biofilm and showed that Δpatrx2 mutants have a defect in alginate production. We demonstrated that AlgA, a cytoplasmic enzyme involved in the synthesis of alginate precursors, is a potential substrate for Patrx2. These results have allowed us to propose a redox regulation of alginate biosynthesis involving the formation of a disulfide bridge catalyzed in the cytoplasm by a paradoxical TDOR.In my second project (Chapter II), we investigated the role of a disulfide bridge identified in the structure of an effector secreted via the H1 type VI secretion system of P. aeruginosa. Because these effectors are injected directly from the cytoplasm of a predatory bacterium into the periplasm of a prey bacterium without undergoing a maturation step in the cytoplasm, they generally lack structural disulfide bridges. We have shown that this disulfide bridge has no effect on the amidase activity or stability and that it appears to be involved in the disassembly of the effector from the proteins of the machinery after their secretion. Our results allow us to propose a new mechanism for the disassembly of a H1-SSTVI effector with proteins of the machinery via the formation of a disulfide bridge.