Régulation de Rho1 par les RhoGAPs pendant l'extension des cellules germinales de la drosophile

Regulation of Rho1 by RhoGAPs during Drosophila Germ Band Extension

• Auteur / Autrice : Swedha Sidharthan
• Direction : Thomas Lecuit
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Biologie du Développement
• Date : Soutenance en 2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IBDM - Institut de Biologie du Développement de Marseille
• Jury : Président / Présidente : Leopold Kurz
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thomas Lecuit, Matteo Rauzi, Grégoire Michaux, Sandrine Etienne-manneville
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Matteo Rauzi, Grégoire Michaux

Mots clés

Mots clés libres

Drosophile

Rho1

RhoGAP

Morphogenèse

Drosophila

Rho1

RhoGAPs

Morphogenesis

Résumé

La morphogenèse est un processus complexe où des cellules épithéliales monocouches se réorganisent pour former des tissus et des organes tridimensionnels différenciés. Ces changements de forme cellulaire sont dirigés par le réseau actomyosine contractile. Un processus morphogénétique tel que l'extension du groupe germinatif ectodermique de Drosophile (GBE) entraîne une intercalation cellulaire, résultant en un échange de voisins cellulaires et une extension subséquente de l'ectoderme dorsal-latéral dans l'axe antéro-postérieur. Cette intercalation est provoquée par les moteurs moléculaires de myosine-II (MyoII) à l'intérieur de l'ectoderme. L'ectoderme de la Drosophile présente deux réservoirs distincts de MyoII, un réservoir pulsatile medio-apical et un réservoir plan-polarisé au niveau des jonctions. L'activation de la MyoII est réalisée par la voie conservée de Rho1. Rho1 est une GTPase qui fonctionne comme un interrupteur moléculaire basculant entre sa forme active liée au GTP et sa forme inactive liée au GDP. Cette transition est régulée respectivement par les GEF (facteurs d'échange de nucléotides guanine) et les GAP (protéines activant la GTPase). Deux modules distincts de régulateurs Rho1 activent les deux réservoirs de MyoII dans l'ectoderme. Un RhoGEF spécifique des jonctions, Dp114RhoGEF, active la Rho1 jonctionnelle, tandis qu'un RhoGEF2 spécifique de la médiane active la Rho1 médiane. Étonnamment, le RhoGEF2 est présent médialement et plan-polarisé au niveau des jonctions, tandis que le Dp114RhoGEF, est uniformément présent à toutes les jonctions, sans polarité planaire. La distribution de ces GEF ne correspond pas à leur rôle dans la régulation de l'activité de MyoII. Par conséquent, les RhoGEFs n'expliquent pas entièrement la signalisation Rho1 plan-polarisée observée. Dans ce contexte, nous avons souhaité étudier les RhoGAPs qui régulent négativement Rho1 dans l'ectoderme pendant le GBE. Au cours de ce projet, nous avons effectué un criblage fonctionnel de 6 RhoGAPs exprimés dans l'embryon précoce. Nous avons identifié deux RhoGAPs qui régulent l'activité de Rho1-MyoII pendant le GBE. Nous avons découvert que GRAF régule uniquement le réservoir de MyoII au niveau des jonctions et qu'il est localisé aux jonctions. Nous avons identifié que GRAF régule MyoII dans l'ectoderme de manière dose-dépendante. Comme plusieurs autres RhoGAPs, GRAF est une protéine multidomaine avec des domaines BAR, PH, RhoGAP et SH3. Les domaines BAR et PH jouent un rôle dans la localisation membranaire. De plus, les domaines BAR ont des rôles d'auto-régulation, où ils se lient et inhibent le domaine catalytique GAP. Nous avons identifié que la localisation membranaire de GRAF est indépendante des domaines BAR et PH, et que le domaine BAR ne joue aucun rôle essentiel dans la régulation de l'activité du domaine GAP. Nous avons également découvert que GRAF est localisé dans l'ectoderme et le mésoderme, mais qu'il n'est pas fonctionnel dans le mésoderme, révélant ainsi un rôle spécifique aux tissus pour GRAF exclusivement dans l'ectoderme. Nous avons ensuite découvert CdGAPr, qui régule spécifiquement Rho1 de manière médiane. Nous avons également identifié que CdGAPr est localisé médialement et plan-polarisé au niveau des jonctions. Grâce à un crible du levure à deux hybrides, nous avons découvert que CdGAPr se lie à MyoII, en particulier à la chaîne lourde de MyoII appelée Zipper. Ainsi, CdGAPr se colocalise avec MyoII dans l'ectoderme, à la fois au niveau des jonctions de manière plan-polarisée et de manière pulsatile médialement. Dans l'ensemble, nous avons identifié l'existence de 2 réservoirs distincts de signalisation Rho1, un réservoir jonctionnel et médian, et ces deux modules de Rho1 sont régulés séparément par leurs propres paires de GEFs et de GAPs. Une autre découverte intéressante de cette étude est la similarité entre la localisation des régulateurs spécifiques des jonctions et des régulateurs spécifiques des médians.

Morphogenesis is an intricate process where single layered epithelial cells reorganize themselves to form differentiated, three-dimensional tissues and organs. These cell shape changes are driven by the contractile actomyosin network. One such morphogenetic process is the Drosophila ectodermal Germ Band Extension (GBE), where cell intercalation results in cell-neighbour exchange and subsequent extension of the dorsal-lateral ectoderm in the anterior-posterior axis. This intercalation is brought about by the Myosin-II (MyoII) molecular motors within the ectoderm. Drosophila ectoderm displays two distinct pools of MyoII, a pulsatile medio-apical pool and a planar polarized junctional pool. The MyoII is activated by the conserved Rho1-Rok pathway. Rho1 is a GTPase and functions like a molecular switch that shifts between its active GTP bound form to its inactive GDP bound form and this transition is regulated by the GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factors) and GAPs (GTPase Activating Proteins) respectively. Two distinct modules of Rho1 regulators activate the two pools of MyoII in the ectoderm. A junction specific RhoGEF- Dp114RhoGEF activates the junctional Rho1 and a medial specific RhoGEF- RhoGEF2 activates the medial Rho1. Surprisingly, the medial specific RhoGEF2 is present medially and planar polarized at the junctions while the junction specific Dp114RhoGEF is present uniformly at all junctions lacking any planar polarity. Strikingly, the distribution of these GEFs do not correspond to their role in regulating MyoII activity. Therefore, RhoGEFs did not fully explain the observed planar polarized Rho1 signaling. In this context, we wanted to study the RhoGAPs that negatively regulate Rho1 in the ectoderm during GBE. We hypothesized that a differential distribution of RhoGAPs could contribute to the planar polarity of Rho1 observed. Through this project, we performed a functional screen of 6 RhoGAPs expressed in the early embryo. We identified two RhoGAPs that regulate Rho1 and hence MyoII activity during GBE. We found GRAF regulates only the junctional pool of MyoII and is localized at the junctions. We identified that GRAF regulates MyoII in the ectoderm in a dose-dependent manner. Like several other RhoGAPs, GRAF is a multidomain protein with BAR, PH, RhoGAP and SH3 domains. The BAR and PH domains are known to play roles in membrane localization. Additionally, the BAR domains are also known to play autoregulatory roles where they bind to and inhibit the catalytic GAP domain. We identified that the membrane localization of GRAF is independent of the BAR and PH domains and that the BAR domain does not play any essential role in regulating the activity of the GAP domain. We also identified that GRAF is localized in the ectoderm and mesoderm but is not functional in the mesoderm. Thus uncovering a tissue specific role for GRAF exclusively in the ectoderm. We further discovered CdGAPr that specifically regulates Rho1 medially. We also identified that CdGAPr is localized medially and planar polarized at the junctions. Through a yeast two-hybrid screen, we discovered CdGAPr binds to MyoII, specifically the heavy chain of MyoII called Zipper. Thus CdGAPr colocalizes with MyoII in the ectoderm both at the junctions in a planar polarized manner and medially as pulses. Collectively, we have identified that there exist 2 distinct pools of Rho1 signaling, a junctional and medial and both these modules of Rho1 are separately regulated by their own pair of GEFs and GAPs. Another interesting finding in this study is the similarity between the localization of the junction specific regulators and the medial specific regulators. This proposes a mechanism where Rho1 is present in a dynamic range of activity rather than the conventional ON/OFF.