Étudier l'interaction entre la signalisation cellulaire et l'organisation tissulaire dans la spécification de trois lignages embryonnaires des cellules souches pluripotentes

Investigating cross-talk between cell signalling and tissue organisation during pluripotent stem cell lineage commitment

• Auteur / Autrice : Thomas Legier
• Direction : Rosanna Dono
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement
• Date : Soutenance le 27/10/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Biologie du Développement de Marseille (IBDM)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM)
• Jury : Président / Présidente : Robert M. Kelly
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Rosanna Dono, Vikas Trivedi, Jérôme Collignon, Jérôme Gros, Elsa Bazellières
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Vikas Trivedi, Jérôme Collignon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines et peptides de signalisation intracellulaire

Gastrulation

Cellules souches pluripotentes induites

Mots clés libres

Cellules souches pluripotentes induites humaine

Glypican-4

Gastrulation

Embryogénèse

Organisation cellulaire/tissulaire

Tgf-B

Humain induced pluripotent stem cells

Glypican-4

Gastrulation

Embryogenesis

Cell/tissue organisation

TGF-B patterning

Résumé

Au cours de mon doctorat, l'objectif principal de mes recherches a été de mettre en évidenceles mécanismes coopératifs entre la signalisation cellulaire et l'organisation tissulaire quirégulent la spécification du destin cellulaire dans le développement humain précoce. À cetégard, la gastrulation représente un système intégré pertinent pour étudier ces interactions.En effet, cet événement développemental complexe conduit à l'émergence des trois couchesgerminales à partir des cellules souches embryonnaires de l’épiblaste et ce, simultanément àune série de mouvements tissulaires et de changements morphologiques des cellulesépiblastiques. Cependant, pour des raisons pratiques et éthiques, l'étude de la régulation dela gastrulation sur embryons est particulièrement difficile.Ainsi, les cellules souches pluripotentes induites humaines ont été largement utilisées pourétudier la régulation des événements développementaux précoces in vitro, car elles sontconsidérées équivalentes aux cellules souches pluripotentes embryonnaires. Il est intéressantde noter qu'en utilisant des cellules souches pluripotentes induites humaines régulées à labaisse pour le GLYPICAN-4, un protéoglycan membranaire connu pour réguler diverses voiesde signalisations en ajustant finement la perception des signaux tout au long dudéveloppement, mon laboratoire d'accueil a découvert que la régulation à la baisse duGLYPICAN-4 dans les cellules souches pluripotentes induites humaines conduit à unedésorganisation épithéliale partielle, mises en évidence par une altération ou une pertelocalisée des jonctions serrées entre les cellules.Dans ce contexte, j'ai pu étudier comment la désorganisation épithéliale affecte la réponsecellulaire aux morphogènes ainsi que la différentiation des cellules souches pluripotentesinduites humaines. Ainsi, j'ai pu montrer que la désorganisation épithéliale était laconséquence d'un ralentissement de la cinétique de l’organisation épithéliale. De manièreintéressante, en réalisant des stimulations avec les morphogènes BMP4 et ACTIVIN A, j'aiégalement montré qu’une perturbation de l’intégrité épithéliale permet aux cellules souchespluripotentes humaines de détecter et de répondre à la signalisation BMP et ACTIVIN demanière efficace et localisé dans l'espace. En effet, mes analyses par immunomarquagemontrent que les motifs d’altération de l’intégrité épithéliale et de réponse aux morphogènesse chevauchent fortement, montrant que l'état de l'organisation épithéliale des cellules souches pluripotentes humaines est un puissant déterminant de leur capacité à détecter etrépondre aux voies de signalisation BMP et ACTIVIN. De même, j'ai démontré que le retarddans la cinétique de la réorganisation épithéliale est suffisant pour prolonger l’activation desvoies de signalisation BMP et ACTIVIN dans les cellules mutantes pour le GLYPICAN-4,conduisant ainsi à une efficacité de différenciation vers le lignage mésendodermique accruedans les zones de désorganisées.Dans l'ensemble, j'ai contribué à mettre en évidence le rôle du GLYPICAN-4 en tant quemodulateur de l'organisation épithéliale dans les cellules souches pluripotentes induiteshumaines ainsi qu’à établir la modulation de l'intégrité épithéliale comme un puissantmécanisme permettant d'affiner la signalisation et la différenciation dans le temps et l'espaceau sein d'un épithélium. Par extension, nous pouvons également émettre l'hypothèse que cesystème de régulation de la réponse aux morphogènes et de différentiation peut égalementêtre pertinent in vivo au cours de la gastrulation ou au cours de tout autre événementdéveloppemental où la signalisation BMP ou ACTIVIN agit sur un tissu épithélial polarisé.

Throughout my PhD, the main objective of my research was to highlight the cooperativemechanisms in between cell signalling and tissue organisation that regulate cell fatespecification and patterning in early human development. In this regard, gastrulationrepresents a relevant integrated system to study these complex cross-talks between cellsignalling and tissue organisation. Indeed, this complex developmental event leads to theemergence of the three embryonic germ layers from the epiblastic embryonic stem cells, andsimultaneously to a series of morphological changes in epiblastic cells, tissue movements, andpatterning events. However, for practical and ethical reasons, the study of gastrulationregulation in embryos is particularly challenging.As a way to bypass the current limitations of studying embryos, human induced pluripotentstem cells have been used extensively to study aspects of the regulation of earlydevelopmental events in vitro, as they are considered equivalent to the embryonic pluripotentstem cells. Interestingly, by using human induced pluripotent stem cells downregulated forthe morphogen regulator GLYPICAN-4, a membrane-bound heparan sulphate proteoglycanknown to fine-tune signal perception throughout development, my host lab discovers thatdownregulation of GLYPICAN-4 in human induced pluripotent stem cells leads to theappearance of patches of epithelial disorganisation highlighted by localised alteration or lossof tight junctions in between cells.In this context, I investigated how epithelial disorganisation affects the morphogen signallingresponse and cell lineage commitment of human induced pluripotent stem cells. Using liveimaging and time course analysis, I was able to show that the patches of epithelialdisorganisation were the consequence of a delayed kinetics of epithelial organisation.Interestingly, using BMP and ACTIVIN stimulation assays, I have also shown that the disruptedepithelial integrity allows human pluripotent stem cells to sense and respond to BMP andACTIVIN signalling in an efficient and spatially regulated manner. Indeed, immunostaininganalysis of the pattern of altered epithelial integrity and morphogen response was highlyoverlapping, showing that the state of epithelial organisation of human pluripotent stem cellsis a potent determinant of their ability to sense and respond to BMP and ACTIVIN signalling.Similarly, I have demonstrated that the delayed kinetics of epithelial reorganisation is sufficient to prolong BMP and ACTIVIN signalling in cells downregulated for GLYPICAN-4,leading to enhanced efficiency of mesendoderm lineage differentiation in areas of epithelialdisorganisation.Overall, I have contributed to highlight GLYPICAN-4 as a modulator of epithelial organisationin human induced pluripotent stem cells, and directly link the modulation of epithelialintegrity as a potent mechanism for fine-tuning morphogens response and differentiation intime and space within an epithelium. By extension, we could also hypothesise that this systemregulating cell signalling response and lineage patterning may also be relevant in vivo duringgastrulation or any developmental event where BMP or ACTIVIN signalling acts on a polarisedepithelial tissue.