Effet du prétraitement biologique des déchets lignocellulosiques sur le rendement en bioH2 et la production d'AGV par fermentation obscure

Effect of biological pretreatment of lignocellulosic waste on bioH2 yield and VFAs production through dark fermentation.

• Auteur / Autrice : Roberto Campos
• Direction : Nicolas Bernet, Arquímedes Cruz López
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : APAB-Biotechnologie, Microbiologie
• Date : Inscription en doctorat le 24/07/2023
• Etablissement(s) : Montpellier, SupAgro en cotutelle avec Universidad Autónoma de Nuevo León
• Ecole(s) doctorale(s) : Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LBE - Laboratoire de Biotechnologie de l'Environnement

Mots clés

Mots clés libres

Déchets lignocellulosiques

Champignons de pourriture blanche

Biohydrogène

Lignocellulosic waste

White rot fungi

Biohydrogen

Résumé

TÍTULO : EFFET DU PRÉTRAITEMENT BIOLOGIQUE DES DÉCHETS LIGNOCELLULOSIQUES SUR LE RENDEMENT EN BIOH2 ET LA PRODUCTION DE VFAs PAR FERMENTATION ANAÉROBIE INTRODUCTION La consommation de combustibles fossiles tels que le charbon et les sous-produits du pétrole a eu des impacts environnementaux négatifs au cours des dernières décennies, car ces combustibles sont considérés comme les principaux polluants atmosphériques en raison des émissions de gaz à effet de serre telles que le dioxyde de carbone (CO2) lors de la combustion. Les combustibles fossiles proviennent de sources finies et leur consommation augmente, représentant 86 % de la demande mondiale d'énergie, le pétrole, le gaz et le charbon représentant respectivement 36 %, 27 % et 23 %, tandis que les sources renouvelables ne représentent que 14 % du total (Abas et al., 2015). En 2018, les émissions liées à la production d'énergie ont atteint un maximum historique de 407 ppm de CO2, dont 44 % provenaient de la combustion du charbon, 33 % du pétrole et 23 % du gaz naturel (REPSOL, 2019). Cependant, en 2021, ce record a été dépassé, atteignant 417 ppm de CO2 dans l'atmosphère (Tiseo, 2022). Au cours des dernières décennies, la recherche liée aux nouvelles énergies propres a augmenté. L'hydrogène (H2) a suscité un intérêt particulier ces dernières années dans le domaine des biocarburants en raison de ses caractéristiques qui confèrent une grande capacité énergétique et une combustion propre, sans émissions de CO2 (Singh et al., 2015). Ce vecteur énergétique peut être produit par différents méthodes thermochimiques, électrochimiques et biologiques (Cieciura-Włoch & Borowski, 2019). Parmi les différentes méthodes biologiques largement utilisées pour produire de l'H2 (bioH2), la fermentation sombre (DF) se distingue comme l'une des méthodes les plus prometteuses pour la production de bioH2 en raison de sa simplicité et de ses caractéristiques de mise à l'échelle facile (Chen et al., 2021). Pendant la DF, la dégradation de la matière organique en bioH2, CO2 et acides gras volatils (VFAs) se produit avec l'aide de différents micro-organismes anaérobies. Cette méthode présente plusieurs avantages, notamment l'utilisation d'une grande variété de déchets en tant que sources de carbone, tels que les déchets agricoles, les eaux usées et les déchets municipaux. Ainsi, la DF contribue au traitement et à la gestion des déchets (Bernardo Ruggeri, Tonia Tommasi, 2015 ; Ghimire et al., 2015 ; Noguer et al., 2022). D'autre part, la DF présente certaines limitations. Par exemple, la complexité des substrats utilisés dans la DF inhibe parfois la production de bioH2. Bien que la DF permette l'utilisation de certains déchets riches en glucides, ces déchets contiennent des polysaccharides complexes (par exemple, lignocellulose et amidon), qui sont difficilement dégradés par les micro-organismes habituellement utilisés en DF (Mattila et al., 2017). Plusieurs études ont utilisé des substrats complexes comprenant des fractions organiques de déchets municipaux, des biomasses riches en lignocellulose (paille de riz ou de blé, et tiges de maïs), du lactosérum et des eaux usées de l'industrie alimentaire (Show et al., 2021). On a constaté que certaines caractéristiques des substrats ont un impact direct sur la production de bioH2. À mesure que la complexité du substrat augmente, la production de bioH2 diminue. Guo et al., (2014) et Monlau et al., (2021) ont rapporté que les sucres réducteurs (sucres simples) contenus dans les substrats représentent la principale fraction de biomasse qui peut être convertie en bioH2. Par conséquent, des résultats positifs ont été obtenus lors de la production de bioH2 par DF, car les concentrations de sucres réducteurs augmentent après le prétraitement du substrat. Pour décomposer les polysaccharides en sucres réducteurs et augmenter la production de biogaz/bioH2, plusieurs méthodes physiques, chimiques et biologiques ont été mises en œuvre comme prétraitement (Ghimire et al., 2015 ; Hendriks & Zeeman, 2009 ; Mussoline et al., 2013 ; Zheng et al., 2014). Les prétraitements physiques sont généralement basés sur le broyage ou la trituration du substrat, les rayons gamma ou l'irradiation par micro-ondes, ainsi que le processus hydrothermal. D'autre part, les prétraitements chimiques consistent généralement en une hydrolyse acide ou alcaline et une ozonolyse (Taherzadeh & Karimi, 2008). Bien que les prétraitements physiques et chimiques soient attractifs pour les applications industrielles en raison de leur efficacité et de leur rapidité, ces méthodes présentent plusieurs inconvénients, par exemple, certaines d'entre elles nécessitent d'énormes quantités d'énergie et génèrent des composés toxiques (Ghimire et al., 2015). Le prétraitement biologique surmonte ces inconvénients dans la dégradation des polysaccharides. Des substrats complexes tels que les déchets lignocellulosiques peuvent être prétraités à l'aide de certaines espèces de champignons et d'actinomycètes qui délignifient et dégradent partiellement les fractions de cellulose de la lignocellulose à travers certaines enzymes (par exemple, l'hémicellulase et la cellulase), favorisant ainsi la formation de sucres réducteurs (Ghimire et al., 2015). Par exemple, la sciure exposée au champignon Pleurotus ostreatus a entraîné une augmentation de 48,0 µmol mL-1 de sucre par rapport au substrat non traité qui ne contenait que 2,5 µmol mL-1. De plus, la saccharification de la paille de riz a montré une augmentation de 75,3 % de la teneur en sucre après un prétraitement avec le champignon Pleurotus florida (Castoldi et al., 2014 ; Mackul´ak et al., 2012 ; Nayan et al., 2017). Les enzymes lignocellulolytiques extraites des champignons (par exemple, xylanases, cellulases et laccases) sont fondamentales dans un large éventail de processus biotechnologiques, y compris la production de biocarburants, et la bioremédiation des sols et de l'eau. De plus, l'industrie pharmaceutique tire parti de ces enzymes pour l'extraction de différents composés (Carrillo-Nieves et al., 2022, Khambhaty et al., 2018). Pendant le prétraitement biologique des substrats lignocellulosiques, certaines espèces de champignons sont utilisées pour la dégradation de la lignine et de l'hémicellulose. Les champignons de pourriture brune (BRF) attaquent la fraction de cellulose, tandis que les champignons de pourriture blanche (WRF) dégradent la fraction de cellulose et de lignine de la lignocellulose à travers des enzymes hydrolytiques. Ainsi, les WRF sont les basidiomycètes les plus efficaces dans la dégradation de la lignocellulose (Bhurat et al., 2020). Le prétraitement biologique des substrats lignocellulosiques surmonte les inconvénients présents dans les prétraitements physiques et chimiques, tels que la consommation élevée d'énergie et la génération de composés toxiques (par exemple, les furfurals et la concentration élevée de VFAs qui affectent la production subséquente de bioH2) (Kudanga & Le Roes-Hill, 2014). Selon cela, les WRF peuvent être utilisés pour augmenter l'efficacité de la DF pour la production de bioH2 en utilisant des substrats riches en lignocellulose, contribuant à la transition énergétique vers des énergies renouvelables et propres. À notre connaissance, seules quelques recherches ont exploré la dégradation des déchets lignocellulosiques par prétraitement biologique utilisant des WRF et leur utilisation ultérieure dans la production de bioH2. Par conséquent, le présent travail vise à étudier une co-digestion de déchets lignocellulosiques composés de pelures de fruits (FRP) et de drêches de brasserie (BSG) en tant que substrat par prétraitement biologique à l'aide des WRF Trametes versicolor et Pleurotus ostreatus par le biais d'un processus de fermentation en état solide pour favoriser la délignification et la saccharification de la lignocellulose afin d'augmenter la concentration de sucres réducteurs et de l'utiliser comme influent dans des bioréacteurs pour la production de bioH2 et de VFAs par DF. Certaines variables telles que le temps de prétraitement, la température et la souche fongique seront étudiées dans la phase de prétraitement, tandis que dans la DF, l'effet du prétraitement sur la production de bioH2, les communautés microbiennes et les voies métaboliques seront évalués. HYPOTHÈSES Le prétraitement biologique des déchets lignocellulosiques à l'aide de champignons de pourriture blanche améliorera la production de biogaz et de bioH2 par le biais du processus de fermentation sombre (DF). OBJECTIFS Objectif général Promouvoir la fermentation des sucres réducteurs par un prétraitement biologique à l'aide de champignons de pourriture blanche sur les substrats lignocellulosiques pour augmenter l'efficacité de la production de bioH2 par DF. Objectifs spécifiques 1. Utiliser les champignons de pourriture blanche (T. versicolor et P. ostreatus) pour le prétraitement biologique des déchets lignocellulosiques tels que les pelures de fruits (FRP) et les drêches de brasserie (BSG) afin de favoriser la génération de sucres réducteurs. 2. Déterminer les caractéristiques physico-chimiques de la co-digestion FRP-BSG (rapport C/N, pH, TCH, TN et RS). 3. Soumettre la co-digestion FRP-BSG à un prétraitement biologique utilisant T. versicolor et P. ostreatus pour la dégradation partielle de la lignocellulose, en ajustant des variables telles que la température et le temps de traitement par l'application d'un plan d'expériences factorielles mixtes 3x3x2. 4. Comparer la production de bioH2 en DF en alimentant le système avec la co-digestion prétraitée et la co-digestion non traitée (témoin) et évaluer le potentiel de production de bioH2 (BHP) en utilisant un consortium microbien comme inoculum issu de boues anaérobies granulaires obtenues à partir d'une station d'épuration des eaux usées. 5. Analyser les paramètres physico-chimiques en DF (pH, DCO, TCH, RS, TS, MS) et évaluer la production de bioH2 et de VFAs. 6. Sélectionner et enrichir un consortium microbien efficace et exploiter la DF dans un bioréacteur discontinu et continu. POTENTIEL INNOVANT Comme mentionné précédemment, les déchets organiques générés dans plusieurs activités économiques, agricoles et industrielles ne sont guère utilisés par les micro-organismes pour produire de l'énergie dans le processus de fermentation obscure en raison de leur complexité. En réponse à ce besoin, cette étude propose une méthodologie de prétraitement pour de tels déchets en utilisant deux champignons de pourriture blanche : T. versicolor et P. ostreatus, largement reconnus dans la littérature pour leur capacité à déligner et à saccharifier les résidus lignocellulosiques. Ce travail contribuera, en plus de la production d'énergie propre, à la gestion et à la valorisation des déchets tels que les épluchures de fruits (FRP) et les drèches de brasserie (BSG), qui sont largement générés quotidiennement. On estime que près de 50 % des déchets solides municipaux sont constitués de déchets organiques (déchets alimentaires, épluchures de fruits et légumes, etc.). De plus, les drèches de brasserie représentent la principale source de déchets générés dans le processus de brassage de la bière, représentant plus de 80 % du total des déchets générés au cours du processus. Le potentiel innovant de ce projet réside dans la méthodologie utilisée, car très peu d'études existent où des bioprocédés tels que la fermentation en état solide pour l'hydrolyse de la lignocellulose utilisant des champignons de pourriture blanche et la fermentation obscure pour la production de bioH2 sont couplés. IMPACT ET AVANTAGES DU PROJET Le projet actuel contribuera à comprendre l'impact du traitement biologique utilisant des champignons de pourriture blanche sur la production de biogaz et de bioH2 par le biais du processus de fermentation obscure. Ce faisant, il explore des techniques novatrices respectueuses de l'environnement pour traiter des substrats complexes, évitant la génération de résidus chimiques et la consommation d'énergie associée aux prétraitements chimiques et physiques. De plus, ce travail contribuera à la transition énergétique en cours des combustibles fossiles vers de nouvelles énergies propres et renouvelables, utilisant les déchets organiques pour la production d'énergie propre et ayant ainsi un impact positif sur l'environnement. Enfin, il contribuera également au développement des ressources humaines qui participeront à la diffusion des connaissances sur la génération d'énergies propres, favorisant le développement durable, ainsi que la diffusion scientifique des processus étudiés et des résultats obtenus. RÉFÉRENCES Abas, N., et al., (2015). Futures, 69, 31–49. https://doi.org/10.1016/j.futures.2015.03.003 Bernardo Ruggeri, Tonia Tommasi, S. S. (2015). BioH2 & BioCH4 Through Anaerobic Digestion. Springer. https://doi.org/10.1007/978-1-4471-6431-9 Bhurat, K. S., et al., (2020). Waste Disposal and Sustainable Energy. https://doi.org/10.1007/s42768-020-00054-9 Carrillo-Nieves, et al., (2022). Biomass Conversion and Biorefinery, 12(2), 253–264. https://doi.org/10.1007/s13399-020-00738-6 Castoldi, R., et al., (2014). Chemical Engineering Journal. https://doi.org/10.1016/j.cej.2014.07.090 Chen, Y., et al., (2021). International Journal of Hydrogen Energy. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2020.11.096 Cieciura-Włoch, W., & Borowski, S. (2019). Journal of Environmental Engineering and Landscape Management, 27(2), 101–113. https://doi.org/10.3846/jeelm.2019.9806 Ghimire, A., et al., (2015). Applied Energy, 144, 73–95. https://doi.org/10.1016/j.apenergy.2015.01.045 Guo, X. M., et al., (2014). International Journal of Hydrogen Energy. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2013.08.079 Hendriks, A. T. W. M., & Zeeman, G. (2009). Bioresource Technology. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.05.027 Khambhaty, Y., et al., (2018). International Journal of Biological Macromolecules. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.06.100 Kudanga, T., & Le Roes-Hill, M. (2014). Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253-014-5810-8 Mackul'ak, T., et al., (2012). Chemical Papers. https://doi.org/10.2478/s11696-012-0171-1 Mattila, H., et al., (2017). Bioresource Technology. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.11.082 Monlau, F., et al., (2012). Environmental Science and Technology. https://doi.org/10.1021/es303132t Mussoline, W., et al., (2013). Critical Reviews in Environmental Science and Technology. https://doi.org/10.1080/10643389.2011.627018 Nayan, N., et al., (2017). Journal of Animal Science. https://doi.org/10.2527/asasann.2017.533 Noguer, M. C., et al., (2022). Energies. https://doi.org/10.3390/en15114048 REPSOL. (2019). Anuario Estadístico-Energético. Dirección de Estudios, Octubre, 169. Show, K. Y., et al., (2012). International Journal of Hydrogen Energy, 37(20), 15616–15631. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2012.04.109 Singh, S., et al., (2015). Renewable and Sustainable Energy Reviews. https://doi.org/10.1016/j.rser.2015.06.040 Taherzadeh, M. J., & Karimi, K. (2008). International Journal of Molecular Sciences. https://doi.org/10.3390/ijms9091621 Tiseo, I. (2022). Atmospheric CO2 concentrations worldwide 1959-2021 | Statista. Statista. Obtenido de https://www.statista.com/statistics/1091926/atmospheric-concentration-of-co2-historic/ Zheng, Y., et al., (2014). Progress in Energy and Combustion Science. https://doi.org/10.1016/j.pecs.2014.01.001

TITLE: EFFECT OF BIOLOGICAL PRETREATMENT OF LIGNOCELLULOSIC WASTE ON BIOH2 YIELD AND VFAS PRODUCTION THROUGH DARK FERMENTATION INTRODUCTION Fossil fuel consumption, such as coal and petroleum by-products, has caused negative environmental impacts during the last decades since these fuels are considered the main air pollutants due to greenhouse gas emissions like carbon dioxide (CO2) during combustion. Fossil fuels derive from finite sources and their consumption is increasing, providing 86% of the global energy demand, with petroleum, gas, and coal accounting for 36%, 27%, and 23%, respectively, while renewable sources just represent a 14% of the total (Abas et al., 2015). In 2018, emissions related to energy generation reached a historic maximum of 407 ppm CO2, of which 44% were derived from coal combustion, 33% from petroleum, and 23% from natural gas (REPSOL, 2019). However, in 2021 this record was surpassed since 417 ppm of CO2 reached the atmosphere (Tiseo, 2022). In the last decades, investigation related to new clean energy has increased. Hydrogen (H2) has gained a special interest in the last years in the biofuels field due to its characteristics that confer great energy capacity and clean combustion, free of CO2 emissions (Singh et al., 2015). This energy vector can be produced using different thermochemical, electrochemical, and biological methods (Cieciura-Włoch & Borowski, 2019). Among the different biological methods to produce H2 (bioH2) widely used, dark fermentation (DF) stands out as one of the most promising methods for bioH2 production due to its simplicity and easy scale-up characteristics (Chen et al., 2021). During DF, the degradation of organic matter into bioH2, CO2, and volatile fatty acids (VFAs) occurs with the aid of different anaerobic microorganisms. This method displays several advantages, including the use of a wide variety of waste as carbon sources, for example, agricultural waste, wastewater, and municipal waste. Thus, DF contributes to waste treatment and management (Bernardo Ruggeri, Tonia Tommasi, 2015; Ghimire et al., 2015; Noguer et al., 2022). On the other hand, DF presents some limitations. For example, the complexity of substrates used in DF sometimes inhibits bioH2 production. Although DF allows the use of some waste with high carbohydrate content, these wastes contain complex polysaccharides (e.g. lignocellulose and starch), which are hardly degraded by the microorganisms usually used in DF (Mattila et al., 2017). Several studies have used complex substrates including organic fractions of municipal waste, lignocellulose-rich biomass (rice or wheat straw, and corn stalks), cheese whey, and wastewater from the food industry (Show et al., 2021). It has been found that certain characteristics of the substrates have a direct impact on bioH2 production. As substrate complexity increases, bioH2 production decreases. Guo et al., (2014) and Monlau et al., (2021) reported that reducing sugars (simple sugars) contained in substrates represent the main biomass fraction that can be converted into bioH2, therefore, positive results have been obtained during bioH2 production through DF, as concentrations of reducing sugars increase after substrate pretreatment. To break down the polysaccharides into reducing sugars and increase biogas/bioH2 production, several physical, chemical, and biological methods have been implemented as pretreatment (Ghimire et al., 2015; Hendriks & Zeeman, 2009; Mussoline et al., 2013; Zheng et al., 2014). Physical pretreatments generally are based on grinding or trituration of substrate, gamma rays, or microwave irradiation, as well as hydrothermal process. On the other hand, chemical pretreatments usually consist of acid or alkaline hydrolysis and ozonolysis (Taherzadeh & Karimi, 2008). Although physical and chemical pretreatments are attractive for industrial applications due to their efficiency and quickness, these methods display several disadvantages, for example, some of them require huge amounts of energy and generate toxic compounds (Ghimire et al., 2015). Biological pretreatment faces those disadvantages in polysaccharides degradation. Complex substrates such as lignocellulosic waste can be pretreated using some fungi and actinomycetes species which delignify and partially degrade cellulose fractions of lignocellulose through some enzymes (e.g., hemicellulase and cellulase) this in consequence favors the formation of reducing sugars (Ghimire et al., 2015). For example, sawdust exposed to Pleurotus ostreatus fungus resulted in an increased content of 48.0 µmol mL-1 sugar as compared to the untreated substrate that contained only 2.5 µmol mL-1. Also, saccharification of rice straw showed an increase of 75.3% in sugar content after pretreatment with Pleurotus florida fungus (Castoldi et al., 2014; Mackul´ak et al., 2012; Nayan et al., 2017). Lignocellulolytic enzymes extracted from fungi (e.g. xylanases, cellulases, and laccases) are fundamental in a wide range of biotechnological processes, including biofuels production, and soil and water bioremediation. In addition, the pharmaceutical industry takes advantage of these enzymes for the extraction of different compounds (Carrillo-Nieves et al., 2022, Khambhaty et al., 2018). During the biological pretreatment of lignocellulosic substrates, some fungi species are used for lignin and hemicellulose degradation. Brown rot fungi (BRF) attack the cellulose fraction, while white rot fungi (WRF) degrade cellulose and lignin fraction of lignocellulose through hydrolytic enzymes. Hence, WRF are the most effective basidiomycetes in lignocellulose degradation (Bhurat et al., 2020). Biological pretreatment of lignocellulosic substrates overcomes the disadvantages present in physical and chemical pretreatments, such as high energy consumption and toxic compounds generation (e.g., furfurals, and high VFAs concentration which affect the subsequent bioH2 production) (Kudanga & Le Roes-Hill, 2014). According to this, WRF can be used to increase the efficiency of DF for bioH2 production using lignocellulose-rich substrates, helping the energy transition to renewable and clean energy. To the best of our knowledge, only a few research have explored the degradation of lignocellulosic waste through biological pretreatment using WRF and its subsequent utilization in bioH2 production. Therefore, the present work pretends to study a co-digestion of lignocellulosic waste consisting of Fruit peels (FRP) and Brewers' spent grain (BSG) as substrate through biological pretreatment using the WRF Trametes versicolor and Pleurotus ostreatus through solid state fermentation process to promote delignification and saccharification of lignocellulose to increase reducing sugars concentration and use it as influent in bioreactors for bioH2 and VFAs production through DF. Some variables such as pretreatment time, temperature, and fungal strain will be studied in the pretreatment phase, while in DF the effect of the pretreatment on bioH2 production, microbial communities, and metabolic pathways will be evaluated. HYPOTHESES Biological pretreatment of lignocellulosic waste using white rot fungi will improve biogas and bioH2 production through the dark fermentation process (DF). OBJECTIVES General objective To promote reducing sugars fermentation through a biological pretreatment using white rot fungi to the lignocellulosic substrates to increase the bioH2 production efficiency through DF. Specific objectives 1. To use white rot fungi (T. versicolor and P. ostreatus) for the biological pretreatment of lignocellulosic waste such as fruit peels (FRP) and brewers' spent grain (BSG) to promote reducing sugars generation. 2. To determine the physicochemical characteristics of the co-digestion FRP-BSG (C/N ratio, pH, TCH, TN, and RS). 3. Submit the FRP-BSG codigestion to a biological pretreatment using T. versicolor and P. ostreatus for partial lignocellulose degradation, adjusting variables such as temperature and treatment time through the application of a 3x3x2 mixed factorial design. 4. To compare bioH2 production in DF by feeding the system with the pretreated co-digestion and unpretreated co-digestion (Control) and evaluate bioH2 production potential (BHP) using a microbial consortium as inoculum from granular anaerobic sludge obtained from a WWTP. 5. To analyze physicochemical parameters in DF (pH, COD, TCH, RS, TS, VS) and evaluate bioH2 and VFAs production. 6. Select and enrich efficient microbial consortium and operate DF in a batch and continuous bioreactor. INNOVATIVE POTENTIAL As mentioned earlier, the organic waste generated in several economical, agricultural, and industrial activities is hardly utilized by microorganisms to produce energy in DF process due to its complexity. In response to this need, this study proposes a pre-treatment methodology for such waste using two white-rot fungi: T. versicolor and P. ostreatus, both widely reported in the literature for their ability to delignify and saccharify lignocellulosic residues. This work will contribute, in addition to the generation of clean energy, to the management and valorization of waste such as FRP and BSG, which are widely generated daily. It is estimated that approximately 50% of municipal solid waste consists of organic waste (food waste, fruit, and vegetable peels, etc.). Furthermore, BSG is the major waste generated in the beer brewing process, accounting for more than 80% of the total waste generated during the process. The innovative potential of this project lies in the methodology employed, as very few studies exist where bioprocesses such as solid-state fermentation for lignocellulose hydrolysis using WRF and DF for bioH2 production are coupled. IMPACT AND BENEFICT OF THE PROJECT The current project will help to understand the impact of biological treatment using white rot fungi on biogas and bioH2 production through the dark fermentation process. In doing so, it investigates novel environmentally friendly techniques for treating complex substrates, avoiding the generation of chemical residues and the energy consumption associated with chemical and physical pretreatments. Furthermore, this work will contribute to the ongoing energy transition from fossil fuels to new, clean, and renewable energies, utilizing organic waste for the generation of clean energy and thereby positively impacting the environment. Finally, it will also contribute to the development of human resources that will contribute to the dissemination of knowledge regarding the generation of clean energies, promoting sustainable development, as well as the scientific dissemination of the processes studied, and the results obtained. REFERENCES Abas, N., et al., (2015). Futures, 69, 31–49. https://doi.org/10.1016/j.futures.2015.03.003 Bernardo Ruggeri, Tonia Tommasi, S. S. (2015). BioH2 & BioCH4 Through Anaerobic Digestion. Springer. https://doi.org/10.1007/978-1-4471-6431-9 Bhurat, K. S., et al., (2020). Waste Disposal and Sustainable Energy. https://doi.org/10.1007/s42768-020-00054-9 Carrillo-Nieves, et al., (2022). Biomass Conversion and Biorefinery, 12(2), 253–264. https://doi.org/10.1007/s13399-020-00738-6 Castoldi, R., et al., (2014). Chemical Engineering Journal. https://doi.org/10.1016/j.cej.2014.07.090 Chen, Y., et al., (2021). International Journal of Hydrogen Energy. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2020.11.096 Cieciura-Włoch, W., & Borowski, S. (2019). Journal of Environmental Engineering and Landscape Management, 27(2), 101–113. https://doi.org/10.3846/jeelm.2019.9806 Ghimire, A., et al., (2015). Applied Energy, 144, 73–95. https://doi.org/10.1016/j.apenergy.2015.01.045 Guo, X. M., et al., (2014). International Journal of Hydrogen Energy. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2013.08.079 Hendriks, A. T. W. M., & Zeeman, G. (2009). Bioresource Technology. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.05.027 Khambhaty, Y., et al., (2018). International Journal of Biological Macromolecules. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.06.100 Kudanga, T., & Le Roes-Hill, M. (2014). Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253-014-5810-8 Mackul'ak, T., et al., (2012). Chemical Papers. https://doi.org/10.2478/s11696-012-0171-1 Mattila, H., et al., (2017). Bioresource Technology. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.11.082 Monlau, F., et al., (2012). Environmental Science and Technology. https://doi.org/10.1021/es303132t Mussoline, W., et al., (2013). Critical Reviews in Environmental Science and Technology. https://doi.org/10.1080/10643389.2011.627018 Nayan, N., et al., (2017). Journal of Animal Science. https://doi.org/10.2527/asasann.2017.533 Noguer, M. C., et al., (2022). Energies. https://doi.org/10.3390/en15114048 REPSOL. (2019). Anuario Estadístico-Energético. Dirección de Estudios, Octubre, 169. Show, K. Y., et al., (2012). International Journal of Hydrogen Energy, 37(20), 15616–15631. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2012.04.109 Singh, S., et al., (2015). Renewable and Sustainable Energy Reviews. https://doi.org/10.1016/j.rser.2015.06.040 Taherzadeh, M. J., & Karimi, K. (2008). International Journal of Molecular Sciences. https://doi.org/10.3390/ijms9091621 Tiseo, I. (2022). Atmospheric CO2 concentrations worldwide 1959-2021 | Statista. Statista. Obtenido de https://www.statista.com/statistics/1091926/atmospheric-concentration-of-co2-historic/ Zheng, Y., et al., (2014). Progress in Energy and Combustion Science. https://doi.org/10.1016/j.pecs.2014.01.001