DevDermTryp - Développement des trypanosomes dermiques

DevDermTryp - Development of dermal trypanosomes

• Auteur / Autrice : Parul Sharma
• Direction : Brice Rotureau, Vincent Jamonneau
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 20/06/2025
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Bases génétiques et moléculaires des interactions hôtes-parasites
• Jury : Président / Présidente : Olivier Silvie
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Brice Rotureau, Keith Matthews, Annette Macleod, Frédéric Bringaud, Luisa Figueiredo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Keith Matthews, Annette Macleod

Mots clés

Mots clés libres

Trypanosomes africains

Niches extravasculaires

Développement

Réservoir

Transmission

Modèle organoïde

African trypanosomes

Extravascular niches

Development

Reservoir

Transmission

Organoid model

Résumé

Trypanosoma brucei sp. est l'organisme responsable de la trypanosomiase humaine africaine. Il s'agit d'un parasite extracellulaire transmis aux hôtes mammifères par la piqure de la mouche tsé-tsé. Les parasites pénètrent alors dans le sang et le système lymphatique où ils se développent. Des données récentes ont révélé que T. brucei maintient en réalité une population extravasculaire dans le derme de suspects séropositifs non confirmés et de patients dont la parasitémie est indétectable. Des infections expérimentales chez la souris ont démontré la présence de quantités substantielles de parasites dans le derme qui restent transmissibles aux mouches tsé-tsé, mettant en évidence la peau comme un réservoir important pour les parasites. Cependant, les traits caractéristiques et les fonctions de ces formes vivant dans la peau ne sont pas encore entièrement compris. Notre étude a caractérisé ces trypanosomes dermiques afin de comprendre leur rôle dans la transmission. Plus précisément, nous nous sommes attachés à comprendre la prolifération, la différenciation et la motilité des parasites entre les compartiments dermique et vasculaire. Pour ce faire, nous avons développé un modèle organoïde de peau sur puce (SoC) optimisé pour l'imagerie quantitative par microscopie confocale. Notre modèle de peau sur puce consiste en une chambre microfluidique contenant trois canaux, incorporant les éléments de la peau vascularisée (Zerventonakis et.al, 2012 et Sriram et.al, 2018). Le dispositif comprend trois couches distinctes : 1) des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine formant le système vasculaire, 2) des fibroblastes dermiques humains intégrés dans un hydrogel à base de fibrinogène représentant le derme, et 3) des kératinocytes constituant l'épiderme. Nous avons validé ce modèle à l'aide de tests de viabilité cellulaires, de diffusion et d'immunofluorescence avec des anticorps spécifiques des différents types cellulaires pour vérifier leur organisation. Puis, nous avons étudié la motilité du parasite, qui est essentielle pour l'établissement de l'infection à la fois chez la mouche tsé-tsé et chez l'homme. Pour comprendre la motilité de T. brucei dans le microenvironnement dense du derme, la vitesse moyenne des parasites a été déterminée dans les canaux vasculaires et dermiques. Les parasites du canal dermique se déplaçaient à une vitesse moyenne significativement plus faible que ceux du canal vasculaire. L'élimination des fibroblastes du canal dermique a légèrement augmenté la vitesse des parasites, alors que l'ajout de collagène l'a significativement augmentée. Ces résultats soulignent le double rôle des fibroblastes dans la motilité de T. brucei : ils peuvent agir comme des barrières physiques réduisant le mouvement des parasites, tout en produisant du collagène qui augmente paradoxalement la vitesse du parasite. En outre, nous avons examiné la différenciation des parasites qui existent sous forme longue proliférative et sous forme trapue au cycle cellulaire arrêté chez l'hôte mammifère. Les formes trapues, adaptées à la transmission, sont principalement responsables de l'établissement de l'infection dans le tube digestif de la mouche tsé-tsé. Notre modèle SoC a révélé une variation du nombre de parasites exprimant un marqueur de la forme trapue dans le canal vasculaire par rapport au canal dermique, des changements notables se produisant à l'interface dermo-vasculaire, soulignant les interactions complexes entre les parasites et leur microenvironnement dermique. En conclusion, nous avons développé un modèle de peau en 3D qui permet l'imagerie et la quantification des trypanosomes fluorescents avec une grande reproductibilité. Ce modèle a révélé des informations essentielles sur la motilité et la différenciation des trypanosomes. Nos recherches futures se concentreront sur ces aspects ainsi que sur la dynamique de prolifération des parasites, afin d'élucider les interactions complexes entre T. brucei et le tissu dermique.

Trypanosoma brucei sp. is an extracellular parasite causing human African trypanosomiases. It is transmitted to the mammalian host by tsetse flies during their blood meals. The fly deposits metacyclic trypomastigotes into the skin dermis. From there, the parasites enter the blood and lymphatic systems. Recent studies revealed that T. brucei maintains a population in the extravascular dermis of unconfirmed seropositive suspects and patients with undetectable parasitemia in blood. Experimental infections in mice demonstrated the presence of substantial quantities of parasites in the dermal niche that remain transmissible to tsetse flies, highlighting the skin as an important reservoir. However, the characteristic traits and functions of these skin-dwelling forms are not yet fully understood. To address this knowledge gap, we characterized these dermal trypanosomes to understand their role in transmission. Specifically, we focused on understanding parasite proliferation, differentiation, and motility between the dermal and vascular compartments. To achieve this, we developed an in-house skin-on-chip (SoC) model optimized for quantitative imaging using confocal microscopy. The skin-on-chip model consists of a microfluidic chamber containing three channels, incorporating elements from both vascularized (Zerventonakis et.al, 2012) and non-vascularized full-thickness skin systems (Sriram et.al, 2018). The model comprises three distinct layers: 1) human umbilical vein endothelial cells forming the vasculature, 2) human dermal fibroblasts embedded in a fibrinogen-based hydrogel populating the dermis, and 3) keratinocytes structuring the epidermis. We validated this model using various assays, including live/dead tests for cell viability, dextran diffusion tests for endothelial integrity, and immunofluorescence with cell-specific antibodies for layer formation. First, we investigated parasite motility, which is essential for T. brucei to establish infection in both tsetse flies and humans. To understand the motility of T. brucei in the dense microenvironment of the dermis, the mean speeds of the parasites were determined in the vascular and dermal channels. Parasites in the dermal channel moved at a significantly lower mean speed compared to those in the vascular channel. Interestingly, removing fibroblasts from the dermal channel slightly increased parasite speed, while adding collagen significantly enhanced it. These results highlight the dual role of fibroblasts in T. brucei motility: they may act as physical barriers reducing parasite movement while also producing collagen, which paradoxically increases parasite speed. Furthermore, we examined the differentiation of T. brucei parasites, which exist as dividing slender and cell cycle arrested stumpy forms in the mammalian host. The stumpy forms, adapted for transmission, are primarily responsible for establishing infection in the tsetse fly's midgut. Our SoC model revealed a variation in number of parasites expressing a stumpy form marker in the vascular channel compared to the dermal channel with notable changes occuring at the dermo-vascular interface, underscoring the complex interplay between parasite biology in the dermal tissue microenvironment. In conclusion, we have successfully engineered a 3D skin model that enables both live and fixed imaging of fluorescently-tagged trypanosome parasites, allowing quantification of key biological parameters with high reproducibility. This model has provided critical insights into fundamental parasitological traits, specifically trypanosome motility and differentiation. Our future investigations will further elucidate these two aspects, along with parasite proliferation dynamics. By understanding these key aspects of parasite biology, we aim to unravel the complex host-parasite interactions that govern T. brucei survival and propagation in dermal tissue.