Caractérisation moléculaire du processus de translocation membranaire de CyaA

Molecular characterization of the CyaA membrane translocation process

• Auteur / Autrice : Gaia Scilironi
• Direction : Sophie Cribier, Alexandre Chenal
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie Physique et Chimie du Vivant
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biophysique Spectroscopies et Modélisation

Mots clés

Mots clés libres

CyaA

Translocation membranaire

Adenylate cyclase

Hemolysine

Bordetella Pertussis

Toxine

CyaA

Membrane translocation

Adenylate cyclase

Hemolysin

Bordetella Pertussis

Toxin

Résumé

La toxine CyaA est un facteur de virulence essentiel produit par B. pertussis, l'agent responsable de la coqueluche. Aux premiers stades de la colonisation des voies respiratoires par B. pertussis, CyaA envahit les cellules eucaryotes et produit des niveaux supra physiologiques d'AMPc, entraînant la mort cellulaire. CyaA est doté d'un mécanisme unique de translocation de son domaine catalytique (ACD) directement à travers la membrane plasmique des cellules cibles, du milieu extracellulaire au cytosol. Le mécanisme moléculaire par lequel CyaA pénètre dans les cellules cibles reste largement inconnu. Il a été récemment démontré qu'après l'insertion des régions hydrophobes de CyaA dans la membrane plasmique, l'ACD est transloqué à travers la membrane plasmique, par une déstabilisation transitoire et locale de l'intégrité de la membrane induite par la région de translocation (TR) de CyaA. De plus, un segment amphipathique au sein de la TR (P454) présente des propriétés membranaires actives, c'est-à-dire qu'il est capable de déstabiliser la membrane plasmique, de transloquer à travers elle (événement flip) et d'interagir avec une haute affinité avec la calmoduline (CaM), favorisant la translocation de l'ACD à travers la membrane plasmique. Ces résultats ont été obtenus grâce à une collaboration interdisciplinaire et synergique entre une équipe IP (dirigée par A. Chenal) et l'équipe SU (dirigée par S. Cribier et N. Rodriguez). Ces résultats, publiés dans Advanced Sciences in 2021, illustrent la productivité scientifique fructueuse de notre collaboration établie. En particulier, ils démontrent que la P454, active dans la membrane, est capable de se déplacer à travers une bicouche lipidique, en utilisant une approche expérimentale, la DIB (droplet interface bilayer), développée par l'équipe SU. L'objectif de la présente thèse SU-IP est de poursuivre le développement de cette collaboration en changeant l'échelle biologique, c'est-à-dire en passant du peptide P454 à la translocation de la protéine CyaA complète à travers les membranes. Le projet de thèse vise à résoudre plusieurs questions en utilisant une combinaison de méthodologies de pointe : nous voulons décrire les étapes successives menant à l'insertion membranaire et à la translocation de CyaA, caractériser la structure et le statut d'oligomérisation de CyaA inséré dans les membranes, identifier les effets de l'acylation de CyaA dans le processus de translocation membranaire et déchiffrer l'effet de l'encombrement moléculaire qui prévaut dans les conditions physiologiques sur la translocation de CyaA. Le projet devrait fournir des données sur la structure et la cinétique des étapes successives menant à la translocation de l'ACD dans le cytosol des cellules cibles. Enfin, ces études permettront de comprendre le processus d'intoxication cellulaire, de concevoir des vecteurs améliorés d'administration d'antigènes à base de CyaA, d'améliorer l'ingénierie d'un vaccin sûr et efficace contre la coqueluche à base de CyaA développé à l'IP.

The CyaA toxin is a key virulence factor produced by B. pertussis, the causative agent of whooping cough. At the early stages of respiratory track colonisation by B. pertussis, CyaA invades eukaryotic cells and produces supra physiological levels of cAMP, leading to cell death. CyaA is endowed with a unique mechanism of translocation of its catalytic domain (ACD) directly across the plasma membrane of target cells from the extracellular milieu into the cytosol. The molecular mechanism by which CyaA enters into target cells remains largely unknown. It has been recently showed that after membrane insertion of the hydrophobic regions of CyaA in the plasma membrane, ACD is translocated across the plasma membrane, through a transient and local destabilisation of the membrane integrity induced by the translocation region (TR) of CyaA. Moreover, an amphipathic segment within TR (P454)exhibits membrane-active properties, i.e., is able to destabilise the plasma membrane, translocate across it (flip event) and interact with high affinity with calmodulin (CaM), favoring the translocation of ACD across the plasma membrane. These results have been obtained thanks to an interdisciplinary and synergistic collaboration between an IP team (led by A. Chenal) and the SU team (led by S. Cribier and N. Rodriguez). These results, published in Advanced Sciences in 2021, illustrate the fruitful scientific productivity of our established collaboration. In particular, they demonstrate that the membrane-active P454 is able to translocate across a lipid bilayer, using an experimental approach, the DIB (droplet interface bilayer), developed by the SU team. The objective of the present SU-IP thesis is to further develop the collaboration by changing the biological scale, i.e. from the P454 peptide to the full-length CyaA protein translocation across membranes. The PhD project aims to solve several questions using a combination of cutting-edge methodologies: we aim to describe the successive steps leading to membrane insertion and translocation of CyaA, to characterise the structure and oligomerization status of the CyaA inserted into the membranes, to identify the effects of CyaA acylation in the membrane translocation process and decipher the effect of molecular crowding that prevails in physiological conditions upon CyaA translocation. The project should provide data on the structure and kinetics of the successive steps leading to the translocation of ACD into the cytosol of target cells. Finally, these studies will be instrumental to: understand the cell intoxication process, design of improved CyaA based antigen delivery vectors, improve the engineering of a safe and efficient CyaA based pertussis vaccine developed at IP.