Etude du rôle du cytosquelette d'actine dans les étapes finales de la cytocinèse

Study of the role of the actin cytoskeleton in the final stages of cytokinesis

• Auteur / Autrice : Anakine Prizins
• Direction : Arnaud Echard
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique cellulaire physiologique et pathologique
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Trafic Membranaire et Division Cellulaire

Mots clés

Mots clés libres

Actine

Cytosquelette

Optogénétique

Cytocinèse

Actin

Cytoskeleton

Optogenetics

Cytokinesis

Résumé

La cytocinèse est la dernière étape de la division cellulaire qui permet la séparation physique des cellules filles. Il a récemment été établi que des défauts de cytocinèse favorise la tumorigenèse in vivo via la formation de cellules tétraploïdes génétiquement instables. Ces cellules sont normalement éliminées, sauf lorsque p53 est mutée, ce qui se produit précisément dans une proportion importante de tumeurs. Ainsi, plus de 40 % des carcinomes humains dérivent d'un état tétraploïde, résultant très probablement d'un défaut de cytocinèse [1]. Dans les cellules animales, la cytocinèse commence par la contraction d'un anneau d'acto-myosine qui entraîne l'invagination du sillon de clivage. Les cellules filles sont ensuite connectées pendant plusieurs heures par un pont intercellulaire (PIC) qui est finalement coupé par la machinerie d'abscission ESCRT-III [2]. Des défauts d'abscission conduisent souvent à une déstabilisation du PIC et donc à des cellules binucléées, tétraploïdes. La compréhension des mécanismes nécessaires à l'abscission revêt donc une importance à la fois fondamentale et médicale. Le rôle du cytosquelette d'actine dans les étapes tardives de la cytocinèse reste largement incompris et pourtant semble jouer un rôle essentiel. Le laboratoire vient de montrer qu'il existe en réalité plusieurs pools indépendants d'actine importants et qui seraient importants pour l'abscission : un pool localisé aux « Entry Points » ou « EP » à l'interface entre le PIC et chaque cellule fille [3], ainsi qu'un pool indépendant d'actine branchée localisé juste en aval du futur site d'abscission (non publié, cf. plus bas). Enfin, la polymérisation massive d'actine aux « Entry points » ou « EP» a été observée suite à l'activation d'un point de contrôle, appelé ''NoCut/Abscission Checkpoint'' [4]. Ce checkpoint stabilise le PIC et retarde l'abscission en réponse à la présence anormale de chromatine à l'intérieur du PIC. Les défauts du point de contrôle conduisent à la génération de cellules tétraploïdes qui, là encore, peuvent favoriser la formation de tumeurs. Pour démontrer l'importance fonctionnelle de l'actine dans l'abscission et le NoCut checkpoint, les outils disponibles (drogues dépolymérisant l'actine comme la Cytochalasin-D) sont insatisfaisants. En effet, leur action globale sur la cellule ne permet pas d'étudier le rôle d'un pool d'actine précis dans des processus de division. Il est donc impossible aujourd'hui d'attribuer une fonction aux différents pools d'actine qui existent lors des étapes de la cytocinèse. Le projet de thèse a pour ambition de créer, valider et d'utiliser un outil d'optogénétique original pour dépolymériser au bon moment et au à l'échelle subcellulaire les différents pools d'actine pour démontrer leurs rôles respectifs dans les étapes finales de la division cellulaire. Lors de mon stage de M2, j'ai commencé à développer cet outil dont les résultats prometteurs devraient assurer la faisabilité de ce projet de thèse. L'outil optogénétique de dépolymérisation locale du réseau d'actine est basé sur la protéine MICAL1, une enzyme qui induit la dépolymérisation des filaments d'actine en les oxydant [5]. MICAL1, par défaut auto-inhibée, peut être activée notamment par la GTPase Rab8 qui interagit directement avec le domaine C-terminal de MICAL1. Notre outil utilise des protéines de fusion contenant CRY2 ou CIBN (qui n'interagissent qu'en présence de lumière bleu) afin de concentrer localement, grâce à la focalisation d'un laser bleu, un variant constitutivement actif et cytosolique de Rab8 sur les filaments d'actine à cibler. Ceci active localement MICAL1 et induit la dépolymérisation locale du réseau d'actine. Mes tests préliminaires ont permis de montrer l'efficacité de l'outil dans des cellules HeLa et permet de proposer des pistes d'évolution pour rendre la dépolymérisation encore plus locale et plus complète. Pour cela, je propose dans un premier temps : 1- De continuer à tester différents protocoles de photo-activation pour obtenir les paramètres optimaux pour dépolymériser l'actine dans des zones de taille variable, adaptées aux questions biologiques qui seront posées (cf. ci-dessous). 2- De déterminer les ratios des constructions CIBN et CRY2 pour avoir le meilleur recrutement local possible de Rab8. Les résultats préliminaires montrent qu'il est nécessaire d'avoir un large excès de CIBN. Je créerai ainsi de nouvelles lignées cellulaires exprimant stablement à des niveaux variés les protéines de fusion CIBN et CRY2 nécessaires à notre outil. Ceci sera fait tant dans les cellules HeLa que des cellules non tumorales RPE-1 ou primaires (progéniteur hépatiques BMEL). 3- L'efficacité sera ensuite systématiquement testée sur différents pools d'actine cellulaires : fibre de stress, actine corticale et actine branchée. 4- Pour encore accroitre l'efficacité de l'outil, nous introduirons protéine de fusion CRY2-Cofiline. In vitro l'action de la Cofiline, capable de cliver les filaments d'actine, couplée à celle de MICAL1, entraine une dépolymérisation massive des filaments d'actine. On s'attend donc à ce que la concentration simultanée de Cofiline et MICAL1 activées provoque une dépolymérisation totale mais locale du réseau d'actine. Dans un deuxième temps, j'utiliserai cet outil pour étudier le rôle fonctionnel de trois pools d'actine différents qui pourraient contrôler l'étape d'abscission : 1- Le pool d'actine associé à la myosine II, nouvellement décrit à l'interface entre le PIC et les cellules filles [3]. Dans des cellules dépourvues de cavéoles l'actine s'accumule anormalement aux EP. Ceci est associé à une forte tension dans le PIC et retarde la polymérisation des ESCRT et donc l'abscission [3]. Si en dépolymérisant localement ce pool d'actine-F dans des cellules dépourvues de cavéoles la tension, la polymérisation des ESCRT-III et l'abscission redeviennent normales je pourrai démontrer que la présence de ce pool d'actine-F anormal est responsable de cette tension et du défaut d'abscission. 2- Dans les cellules normales il existe un pool d'actine branché par le complexe Arp2/3 juste en aval du futur site d'abscission (résultats non publiés du laboratoire). Ce réseau très localisé d'actine-F semble définir limiter la polymérisation des ESCRT-III au site d'abscission. En dépolymérisant globalement l'actine-F cellulaire, les filaments d'ESCRT-III n'arrivent pas à se concentrer et l'abscission est défectueuse. Dans des cellules normales, je dépolymériserai spécifiquement ce pool d'actine par l'outil d'optogénétique, et pourrai ainsi conclure si, fonctionnellement, ce pool représente une barrière stérique qui permet aux ESCRT-III de rester concentrées proches du midbody et ainsi provoquer l'abscission. 3- Comme décrit ci-dessus, l'activation du NoCut checkpoint par un défaut de ségrégation du matériel génétique est associée à une forte polymérisation d'actine-F aux EP, probablement pour stabiliser le PIC et éviter la formation de cellules tétraploïdes. Dans les cellules présentant des ponts d'ADN, je dépolymériserai spécifiquement les pools d'actine-F observés aux EP. Si cela induit la déstabilisation du PIC et la formation de cellules binucléées, je pourrai conclure que ces pools d'actine sont essentiels au NoCut checkpoint. En conclusion, ce projet devrait permettre de résoudre la fonction de plusieurs pools distincts d'actine dans l'abscission et pendant l'activation du NoCut checkpoint. Ceci permettra de démontrer où, quand et comment l'actine peut prévenir la formation de cellules tétraploides. De plus, l'outil original d'optogénétique ainsi développé pourrait servir à étudier déterminer le rôle local de l'actine dans d'autres fonctions cellulaires clés comme la phagocytose ou la migration cellulaire. Références PMID : [1] 30523339, [2] 29438904, [3] 35417244, [4] 34943860, [5] 32321914

Cytokinesis is the last step of cell division that allows the physical separation of daughter cells. It has recently been established that defects in cytokinesis promote tumorigenesis in vivo via the formation of genetically unstable tetraploid cells. These cells are normally eliminated except when p53 is mutated, which occurs in a significant proportion of tumors. Thus, more than 40% of human carcinomas derive from a tetraploid state, most likely resulting from a defect in cytokinesis [1]. In animal cells, cytokinesis starts with the contraction of an acto-myosin ring that leads to the invagination of the cleavage furrow. Daughter cells are then connected for several hours by an intercellular bridge (ICB) that is finally severed by the ESCRT-III abscission machinery [2]. Abscission defects often lead to destabilization of the ICB and thus to binucleated, tetraploid cells. Understanding the mechanisms required for abscission is therefore of both fundamental and medical importance. The role of the actin cytoskeleton in the late stages of cytokinesis remains largely misunderstood and yet seems to play an essential role. The laboratory has just shown that there are in fact several important independent pools of actin that would be important for abscission: a pool localized at the ''Entry Points'' or ''EP'' at the interface between the PIC and each daughter cell [3], as well as an independent pool of branched actin localized just downstream of the future abscission site (unpublished, see below). Finally, the massive polymerization of actin at the ''Entry points'' or ''EP'' was observed following the activation of a checkpoint, called ''NoCut/Abscission Checkpoint'' [4]. This checkpoint stabilizes the ICP and delays abscission in response to the abnormal presence of chromatin within the ICP. Defects in the checkpoint lead to the generation of tetraploid cells, which again can promote tumor formation. To demonstrate the functional importance of actin in abscission and the NoCut checkpoint, the available tools (actin depolymerizing drugs such as Cytochalasin-D) are unsatisfactory. Indeed, their global action on the cell does not allow to study the role of a specific actin pool in division processes. It is therefore impossible today to attribute a function to the different actin pools that exist during the stages of cytokinesis. The ambition of the thesis project is to create, validate and use an original optogenetic tool to depolymerize at the right time and at the subcellular level the different actin pools in order to demonstrate their respective roles in the final stages of cell division. During my M2 internship, I started to develop this tool whose promising results should ensure the feasibility of this thesis project. The optogenetic tool for local actin network depolymerization is based on the MICAL1 protein, an enzyme that induces actin filament depolymerization by oxidizing it [5]. MICAL1, by default auto-inhibited, can be activated by the GTPase Rab8 which interacts directly with the C-terminal domain of MICAL1. Our tool uses fusion proteins containing CRY2 or CIBN (which interact only in the presence of blue light) to locally concentrate, by focusing a blue laser, a constitutively active and cytosolic variant of Rab8 on the actin filaments to target. This locally activates MICAL1 and induces local depolymerization of the actin network. My preliminary tests have shown the efficiency of the tool in HeLa cells and allow me to propose evolutionary avenues to make depolymerization even more local and more complete. For that, I propose in a first step: 1- To continue to test different photo-activation protocols to obtain the optimal parameters to depolymerize actin in areas of variable size, adapted to the biological questions that will be asked (see below). 2- To determine the ratios of CIBN and CRY2 constructs to have the best possible local recruitment of Rab8. Preliminary results show that it is necessary to have a large excess of CIBN. I will thus create new cell lines stably expressing at various levels the CIBN and CRY2 fusion proteins needed for our tool. This will be done in HeLa cells as well as in non-tumor RPE-1 or primary cells (BMEL liver progenitor). 3- The efficiency will then be systematically tested on different pools of cellular actin: stress fiber, cortical actin and branched actin. 4- To further increase the efficiency of the tool, we will introduce CRY2-Cofilin fusion protein. In vitro, the action of Cofilin, capable of cleaving actin filaments, coupled with that of MICAL1, leads to a massive depolymerization of actin filaments. It is therefore expected that the simultaneous concentration of activated Cofilin and MICAL1 will cause a total but local depolymerization of the actin network. In a second step, I will use this tool to study the functional role of three different actin pools that could control the abscission step: 1- The newly described myosin II-associated actin pool at the interface between the ICP and daughter cells [3]. In cells lacking caveolae, actin accumulates abnormally at the EPs. This is associated with high tension in the PIC and delays ESCRT polymerization and thus abscission [3]. If by locally depolymerizing this F-actin pool in cells without caveolae the tension, the polymerization of ESCRT-III and the abscission become normal again I will be able to demonstrate that the presence of this abnormal F-actin pool is responsible for this tension and the abscission defect. 2- In normal cells, there is an actin pool connected by the Arp2/3 complex just downstream of the future abscission site (unpublished results from the laboratory). This highly localized F-actin network seems to define the limitation of ESCRT-III polymerization at the abscission site. By globally depolymerizing the cellular F-actin, ESCRT-III filaments fail to concentrate and abscission is defective. In normal cells, I will specifically depolymerize this actin pool by the optogenetic tool, and thus be able to conclude whether, functionally, this pool represents a steric barrier that allows ESCRT-IIIs to remain concentrated close to the midbody and thus cause abscission. 3- As described above, activation of the NoCut checkpoint by a defect in the segregation of genetic material is associated with strong F-actin polymerization at the EPs, presumably to stabilize the PIC and avoid the formation of tetraploid cells. In cells with DNA bridges, I will specifically depolymerize the F-actin pools observed at EPs. If this induces the destabilization of the PIC and the formation of binucleated cells, I will be able to conclude that these actin pools are essential for the NoCut checkpoint. In conclusion, this project should resolve the function of several distinct actin pools in abscission and during activation of the NoCut checkpoint. This will allow to demonstrate where, when and how actin can prevent tetraploid cell formation. Furthermore, the original optogenetic tool thus developed could be used to study the local role of actin in other key cellular functions such as phagocytosis or cell migration. PMID references : [1] 30523339, [2] 29438904, [3] 35417244, [4] 34943860, [5] 32321914