Manipulation en profondeur de l'activité des circuits neuronaux avec la microscopie multiphotonique et l'optogénétique

In-depth manipulation of neuronal circuit activity with multi-photon microscopy and optogenetics

• Auteur / Autrice : Aysha Shazmina Mohamed lafirdeen
• Direction : Serge Charpak
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Inscription en doctorat le 01/01/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la vision (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Neuroscience of Neuron, Glia, Vessel Interactions

Mots clés

Mots clés libres

Holographie

Excitation à trois photons

Cortex visuel primaire

Couche 6

Circuits neuronaux

Holography

Three-photon excitation

Primary visual cortex

Layer 6

Neural circuits

Résumé

La vision est le principal sens impliqué dans la navigation spatiale. Les troubles de la fonction visuelle affectent des millions de personnes dans le monde, dont la capacité à accomplir les tâches quotidiennes est compromise. Le développement de thérapies efficaces requiert la compréhension de ce qui construit une représentation cohérente de la scène visuelle, c'est-à-dire la dissection du réseau fonctionnel complet de l'œil au cortex. Chez les mammifères, le transfert d'informations de la périphérie au néocortex implique un ensemble de circuits dans les aires sous-corticales et corticales. Dans V1, la couche 6 apparaît comme un nœud modulateur clé, transmettant des informations contextuelles au traitement du flux d'informations visuelles, et affectant le traitement visuel par une action coordonnée des connexions intracorticales aux couches superficielles et des projections cortico-thalamiques (Olsen, et al 2012). Pour disséquer le rôle complexe de la couche 6, nous proposons d'utiliser de nouvelles technologies qui permettent de surveiller et de manipuler l'activité neuronale dans les circuits visuels corticaux avec une précision à l'échelle d'un neurone unique. Au cours de la dernière décennie, l'optogénétique a été proposée comme stratégie génétique pour contrôler et manipuler l'activité neuronale en délivrant de la lumière dans le cerveau. L'excitation biphotonique (2P) est actuellement la technique optique de référence pour l'imagerie fonctionnelle in vivo et la photostimulation des neurones dans un volume 3D). Cependant, la diffusion de la lumière limite les expérimentations 2P à des zones corticales superficielles s'étendant seulement sur quelques centaines de microns dans le cerveau, empêchant le suivi et la manipulation de l'activité neuronale avec une résolution unicellulaire jusqu'au cortex L6. L'imagerie fonctionnelle du cortex entier est actuellement possible grâce à l'excitation à trois photons (3P) grâce l'atténuation de la diffusion due aux longueurs d'onde d'illumination plus grandes (1300-1700 nm) et à la suppression du bruit de fond due à un meilleur confinement du processus d'excitation. Cependant, la photostimulation 3P in vivo des neurones dans la couche corticale profonde n'a pas encore été démontrée. Dans ce projet, nous visons à réaliser l'activation lumineuse en profondeur en intégrant les nouvelles approches optiques 3P établies dans les laboratoires Emiliani et Charpak. Nous appliquerons ces innovations optiques pour étudier la modulation corticale de la couche 6 du traitement de l'information visuelle. Objectif 1. Tout d'abord, différentes stratégies seront testées pour l'activation neuronale en profondeur en travaillant sur 2 microscopes développés sur mesure : un microscope récemment développé par l'équipe Emiliani pour l'excitation holographique 3P parallèle et l'imagerie 2P-3P Ca2+ in vitro, et un système d'imagerie 3P in vivo développé sur mesure avec une longueur d'onde d'excitation accordable développé dans le laboratoire de Charpak. Les conditions d'excitation et les protéines photosensibles (opsines) optimales seront sélectionnées et testées sous photostimulation 3P in vitro. Nous démontrerons ensuite la photoactivation 3P des neurones de la couche 6 in vitro et in vivo et nous sélectionnerons les meilleures conditions d'activation pour cibler plusieurs cellules simultanément et minimiser l'échauffement des tissus. Objectif 2. Après validation de l'objectif 1, l'opsine la plus appropriée sera exprimée dans les neurones de la couche 6 et un rapporteur calcique sera exprimé dans les couches corticales superficielles pour l'imagerie de l'activité neuronale. Le système optique proposé permettra de contrôler l'activité des cellules excitatrices et/ou inhibitrices de la couche 6 au cours d'une stimulation visuelle des circuits neuronaux des couches 2/3 avec une précision unicellulaire.

Vision is the primary sense involved when we navigate the world. Impairments of visual function affect millions of people worldwide, who experience a compromised capability of accomplishing everyday tasks. The development of efficient therapies needs the understanding of what builds up a coherent representation of the visual scene, i.e. the dissection of the complete functional network from the eye to the cortex. In mammalians, information transfer from the periphery to the neocortex involves an ensemble of circuits in subcortical and cortical areas. In V1, layer 6 appears as a key modulatory node, transmitting contextual information to the processing of visual information flow and affecting visual processing through a coordinated action of intracortical connections to superficial layers and cortico-thalamic projections (Olsen, et al 2012). To dissect the complex role of layer 6, we propose to use novel technologies that allow to monitor and manipulate neuronal activity in cortical visual circuits with single-neuron precision (Emiliani et al. 2015).In the last decade, optogenetics was proposed as a genetic strategy to monitor and manipulate neuronal activity by delivering light into the brain (Yizhar et al, 2011). Two-photon excitation (2PE) is at the moment the gold standard optical technique for in vivo functional imaging (Grienberger, Konnerth 2012) and light-targeting photostimulation of neurons (Ronzitti et al. 2017) across a 3D volume (Paker et al 2015, Rickgauer et al. 2014, Mardinly et al 2018, Carrillo-Reid et al. 2016, Ronzitti et al. 2018, Chen et al. 2019). Nevertheless, light scattering limits 2PE investigations to superficial cortical areas extending only few hundred microns in the brain, and precluding the monitoring and manipulation of neuronal activity with single-cell resolution down to cortex L6. Whole cortical functional imaging is currently reached under three-photon excitation (3PE) (Kobat et al. 2011, Ouzounov et al. 2017, Abdeladim et al 2019) thanks to an attenuation of scattering due to longer illumination wavelengths (1300-1700 nm) and suppression of background due to better confinement of the excitation process. Still, in vivo 3P photostimulation of neurons in deep cortical layer has not been achieved yet. In this project we aim at achieving light activation in depth by integrating the novel 3P optical approaches established in Emiliani and Charpak labs (Horton et al 2013, Xu et al. 1996). We will apply these optical innovations to study Layer 6 cortical modulation of the visual information processing. Aim 1. First, strategies will be tested for in-depth neuronal activation by working on 2 custom-developed microscopes: precisely, a recently developed microscope in Emiliani team for parallel 3P holographic excitation and 2P-3P Ca2+ imaging in vitro and a custom-developed in vivo 3P imaging system with tunable excitation wavelength developed in Charpak lab. The most efficient excitation conditions and photosensitive proteins (opsins) will be selected and tested under 3P photostimulation in vitro. Then we will demonstrate 3P photoactivation of Layer 6 neurons in vitro and in vivo and select the best activation conditions to target multi-cells and minimize tissue heating. Aim 2. After validation of 3P optogenetic experiments in vivo, the most suitable opsin will be expressed in neurons of Layer 6, and a calcium reporter will be expressed in superficial cortical layers for neuronal activity imaging. The proposed optical system will enable the control of excitatory and/or inhibitory cell activity in L6 during visually driven activity of Layer II/III neuronal circuits with single-cell precision.