Mécanismes et impacts physiopathologiques des expansions CTG dans le système nerveux d'un modèle de souris conditionnel de CDM

Mechanisms and physiopathological impacts of CTG expansions in the nervous system of a conditional mouse model of CDM

• Auteur / Autrice : Pauline Megalli
• Direction : Geneviève Gourdon
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche en myologie (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Repeat Expansions & Myotonic Dystrophy - REDs

Mots clés

Mots clés libres

Dystrophie myotonique de type 1

Forme congénitale

Motoneurones

Modèle de souris inductible

Myotonic dystrophy type 1

Congenital form

Motor neurons

Inducible mouse model

Résumé

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie héréditaire dominante multisystémique causée par une répétition CTG étendue et instable, dans la région 3'-non traduite du gène de la protéine kinase de la dystrophie myotonique (DMPK). Le gène DMPK normal contient 5 à 37 répétitions CTG, tandis que les patients atteints de DM1 présentent des répétitions étendues, de 50 à plusieurs milliers. Le nombre de répétitions CTG augmente au fil des générations et est corrélé à la gravité clinique et à l'âge d'apparition de la maladie. Les transcriptions mutantes de l'ARN DMPK forment des foyers d'ARN nucléaires, interférant avec le programme d'épissage d'un sous-ensemble de gènes régulés par le développement dans divers tissus. La forme la plus sévère de la maladie est la forme congénitale de la DM (CDM), caractérisée par une hypotonie générale et une détresse respiratoire à la naissance et est souvent associée à un retard de développement moteur et à une déficience intellectuelle sévère. Mon laboratoire hôte a développé un modèle de souris (DMSXL), qui est le seul à reproduire non seulement l'instabilité somatique et intergénérationnelle des répétitions CTG, mais aussi les caractéristiques phénotypiques de la DM1. Plus récemment, le laboratoire a observé des taux très élevés de foyers d'ARN dans les motoneurones des nerfs crâniens chez les nouveau-nés DMSXL. Les nouveau-nés DMSXL présentent une mortalité élevée, des problèmes d'alimentation et des anomalies respiratoires, ce qui suggère des symptômes graves de la forme congénitale de la maladie. Il est intéressant de noter que les motoneurones de différents nerfs crâniens ont des fonctions vitales pour les comportements d'alimentation, de succion et de respiration nécessaires à la survie après la naissance. Cependant, en raison de l'expression ubiquitaire du gène DMPK, un lien direct entre les motoneurones et le phénotype observé reste à démontrer. Le premier objectif de mon projet de thèse est d'étudier les impacts physiopathologiques des ARNs DMPK mutants exprimés dans les motoneurones de souris transgéniques nouveau-nées. Pour atteindre cet objectif, mon laboratoire hôte a remplacé le promoteur DMPK dans le transgène des DMSXL par un promoteur inductible contrôlé par la tétracycline (TRE3G-CMV) (données non publiées). Ceci a donné naissance à deux nouvelles lignées de souris, renommées TurboXL. Pour mon projet, j'ai besoin d'établir des souris doubles transgéniques Chat-TR3G ; TurboXL. Dans ce nouveau modèle de souris, DMPK ne sera exprimée que dans les neurones cholinergiques, y compris les motoneurones (MN), après l'administration de doxycycline, dans une fenêtre temporelle choisie. Par conséquent, nous pourrons choisir la fenêtre temporelle que nous souhaitons pour l'expression de DMPK. Nous étudierons le phénotype des souriceaux P7 en suivant leur respiration par pléthysmographie (en collaboration avec L. Bodineau, SU et B. Matrot, Phenopups), leurs capacités à se nourrir ainsi que leur développement sensorimoteur à travers différents tests (analyse de la marche, test du réflexe de redressement, test géotaxique négatif). Enfin, l'impact de l'ARN mutant exprimé dans les MN sera évalué par histologie des noyaux 12N et 7N. Les jonctions neuromusculaires seront également étudiées par immunofluorescence afin d'évaluer les conséquences d'un éventuel dysfonctionnement du MN au niveau de l'innervation et du développement musculaire. Le second objectif de mon projet consiste à élucider les mécanismes à l'origine des phénotypes observés à l'aide d'analyses omiques et d'études fonctionnelles dans des modèles cellulaires. Dans ce but, des micro-prélèvements de coupes du tronc cérébral seront effectués pour extraire l'ARN et les protéines des noyaux 12N et 7N pour ensuite procéder à des analyses RNAseq et protéomiques en collaboration avec les plateformes de l'ICM & Imagine. Les données seront analysées avec l'informaticien du laboratoire, et les gènes candidats seront sélectionnés en fonction de la sévérité du défaut, et de la pertinence de leurs fonctions. Les défauts d'expression seront ensuite validés dans les micro-prélèvements ainsi que dans les cellules iPS humaines différenciées en MN crâniens (en collaboration avec C. Martinat de l'I-Stem) par RT-PCR, qRT-PCR et immunofluorescence selon l'anomalie d'expression. Enfin, j'étudierai les impacts moléculaires des défauts des gènes candidats en utilisant à la fois des cellules iPS et des souris en surexprimant et/ou en éliminant ces gènes. Les mécanismes conduisant à la forme congénitale de la dystrophie myotonique ne sont pas très bien compris à ce jour. Mes résultats permettront de mieux comprendre le rôle des MN dans la CDM et leurs impacts sur l'innervation des muscles en aval, importants pour la survie pendant la période néonatale. Ils pourraient ensuite conduire au développement de thérapies ciblant les défauts moléculaires qui sous-tendent les symptômes multisystémiques caractérisant la dystrophie myotonique. J'acquerrai et améliorerai mon expertise en biologie moléculaire, histologie, analyses omiques, biologie cellulaire, ingénierie génomique et expérimentation animale.

Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a dominantly multisystemic inherited disorder caused by an unstable expanded CTG repeat, in the 3'-untranslated region of the Dystrophy Myotonic Protein Kinase (DMPK) gene. The normal DMPK gene contains 5 to 37 CTG repeats, while DM1 patients present expanded repeats, from 50 up to several thousands. The number of CTG repeats increases throughout the generations, and is correlated with clinical severity and age of onset. Mutant DMPK RNA transcripts form nuclear RNA foci, interfering with the splicing program of a developmentally regulated subset of genes in various tissues. The most severe form of the disease is the congenital DM form (CDM), characterized by general hypotonia and respiratory distress at birth and is often associated with delayed motor development and severe intellectual disability. My host laboratory has developed a mouse model (DMSXL), which is the only one to reproduce not only somatic and intergenerational CTG repeat instability, but also phenotypic features of DM1. More recently, the laboratory observed very high levels of RNA foci in motor neurons of the cranial nerves in DMSXL neonates. DMSXL neonates have high mortality, feeding problems and respiratory defects suggesting severe symptoms of the congenital form of the disease. Interestingly, motor neurons from different cranial nerves have vital functions for feeding, suckling and breathing behaviors needed for survival after birth. However, due to the ubiquitous expression of the DMPK gene, a direct link between the motor neurons and the observed phenotype remains to be demonstrated. The first aim of my PhD project is to study the pathophysiological impacts of mutant DMPK RNAs expressed in motor neurons of transgenic neonate mice. To achieve this goal, my host laboratory replaced the DMPK promoter in the transgene of DMSXL by a Tetracycline-Controlled inducible promotor (TRE3G-CMV) (unpublished data). This resulted in two new mouse lines, renamed TurboXL. For my project, I need to establish double transgenic Chat-TR3G; TurboXL mice. In this new mouse model, DMPK will only be expressed in cholinergic neurons including motor neurons (MN) after doxycycline administration, in a chosen time window. Therefore, we will be able to choose the time window we desire for the expression of DMPK. We will study the phenotype of P7 pups by monitoring their breathing by plethysmography (in collaboration with L. Bodineau, SU and B. Matrot, Phenopups), their feeding capacities as well as their sensorimotor development through various tests (gait analysis, righting reflex test, negative geotaxic test). Finally, the impact of mutant RNA expressed in MN will be assessed by histology of the 12N and 7N nuclei. Neuromuscular junctions will also be studied by immunofluorescence to evaluate the consequences of a possible dysfunction of the MN at the level of innervation and muscle development. The second objective of my project consists in unravelling the mechanisms behind the observed phenotypes using omics analyses and functional studies in cell models. To this aim, micro-punches of brainstem slices will be performed to extract RNA and proteins from 12N and 7N nuclei to later proceed to RNAseq and proteomics analyses in collaboration with ICM & Imagine platforms. Data will be analyzed with the laboratory informatician, and candidate genes will be selected according to the severity of the defect, and the relevance of their functions. Expression defects will then be validated in micro-punches as well as in human iPS cells differentiated into cranial MN (in collaboration with C. Martinat from I-Stem) by RT-PCR, qRT-PCR and immunofluorescence depending on the expression abnormality. Finally, I will investigate the molecular impacts of the candidate genes defects using both iPS cells and mice by overexpressing and/or knocking down those genes. The mechanisms leading to the congenital form of myotonic dystrophy are not very well understood to date. My results will provide a better understanding of the role of MN in CDM and their impacts on the innervation of downstream muscles, important for survival during the neonatal period. They might later lead to the development of therapies targeting the molecular defects that underlie the multisystemic symptoms characterizing myotonic dystrophy. I will acquire and improve my expertise in molecular biology, histology, omics analyses, cellular biology, genome engineering and animal experimentation.