Organisation et dynamique du cytosquelette dans la dystrophie myotonique de type 1

Organization and dynamics of the cytoskeleton in myotonic dystrophy type 1

• Auteur / Autrice : Paul Magneron
• Direction : Mario Gomes pereira
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/01/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Myologie
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Repeat Expansions & Myotonic Dystrophy - REDs

Mots clés

Mots clés libres

Astrocyte

Dystrophie Myotonique de type 1

Cytosquelette

Neurone

Triplet répété

Arn

Astrocyte

Myotonic dystrophy type 1

Cytoskeleton

Neuron

Trinucleotide repeat

Rna

Résumé

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie multisystémique potentiellement mortelle. La prévalence de la DM1 est estimée à 1/3 000- 1/8 000 individus dans le monde, ce qui en fait la forme la plus courante de dystrophie musculaire chez les adultes (1). Outre les symptômes musculaires typiques, le système nerveux central (SNC) est gravement compromis par des troubles cognitifs débilitants et des modifications du comportement, qui ont un impact considérable sur la qualité de vie des patients et de leurs familles (2). La DM1 est causée par l'expansion anormale d'une répétition d'ADN trinucléotidique non codante dans l'UTR 3' du gène DMPK. Les transcrits DMPK portant des répétitions CUG non codantes s'accumulent en agrégats nucléaires (ou foyers d'ARN), perturbant l'activité d'importantes protéines de liaison à l'ARN, qui contrôlent l'épissage alternatif, entre autres aspects du métabolisme de l'ARN (3). Malgré les progrès réalisés dans la compréhension de la pathogenèse moléculaire dans le muscle, les molécules intermédiaires et les voies conduisant à la neurobiologie de la maladie restent largement inconnues, ce qui ralentit le développement de thérapies efficaces ciblant le SNC. Nous avons précédemment généré un modèle de souris transgénique de la DM1 qui constitue un outil utile pour étudier la pathogenèse moléculaire de la maladie (4, 4, 5). pathogenèse moléculaire de la maladie (4, 5). En utilisant ces souris, nous avons recueilli des preuves d'anomalies astrocytaires prononcées en réponse à la mutation DM1. en réponse à la mutation DM1. En particulier, le séquençage global de l'ARN et l'analyse phophoprotéomique des astrocytes primaires dérivés de ces souris ont révélé des anomalies dans les transcriptions et les protéines liées au cytosquelette (6). Le dysfonctionnement du cytosquelette a été confirmé par la réduction, la désorganisation des filaments d'actine et la migration erratique des astrocytes cultivés provenant de souris DM1 (7). Les astrocytes sont très ramifiés et leur fonction dépend étroitement du rôle du cytosquelette pour maintenir les morphologies cellulaires complexes. Le cytosquelette est très dynamique, passant par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation régulés par des protéines régulatrices du cytosquelette. Le renouvellement du cytosquelette est essentiel au développement et au maintien du système nerveux, à la migration cellulaire et à la réponse aux blessures. Il n'est pas surprenant que des mutations dans les composants et les régulateurs du cytosquelette aient été trouvées dans de multiples maladies neurologiques (8). J'émets l'hypothèse que la DM1 affecte l'organisation et la dynamique du cytosquelette. Pour tester l'implication du dysfonctionnement du cytosquelette dans les maladies cérébrales liées à la DM1, ce projet tirera parti d'une souris DM1 unique, afin de répondre aux objectifs suivants : 1. Étude de la morphologie cellulaire, de la structure et de la dynamique du cytosquelette. Des méthodes améliorées de microscopie et d'analyse seront mises en œuvre pour caractériser et quantifier les conséquences de l'expansion des répétitions DM1 sur la morphologie cellulaire des astrocytes de la souris DM1. Des méthodes fluorescentes à haute résolution seront utilisées pour déterminer l'organisation, le renouvellement et la dynamique du cytosquelette dans les astrocytes de souris DM1 en culture. Cette tâche bénéficiera de la collaboration de chercheurs de l'institut hôte ayant une forte expertise en biologie du cytosquelette et en imagerie des cellules vivantes. 2. Validation moléculaire du séquençage de l'ARN et de la protéomique. Pour découvrir les mécanismes moléculaires à l'origine des phénotypes cellulaires et du cytosquelette, la caractérisation phénotypique des cellules de souris DM1 sera complétée par l'analyse moléculaire des intermédiaires pathologiques pertinents identifiés dans nos approches précédentes de séquençage de l'ARN et de phosphoprotéomique. Les différences quantitatives dans l'expression des gènes seront étudiées par RT-PCR quantitative et western blot, tandis que les défauts d'épissage seront confirmés par RT-PCR. La phosphorylation anormale des protéines sera confirmée par immunodétection par western blot avec des anticorps phospho-spécifiques, ou par électrophorèse 2D en collaboration avec la plateforme protéomique SU P3S (https://www.p3s.sorbonne-universite.fr/). 3. Évaluation des stratégies chimiques de modification du cytosquelette. La prise de conscience du fait que la perturbation du cytosquelette joue un rôle central dans les maladies neurologiques a ouvert la possibilité de bénéficier du repositionnement des modificateurs chimiques du cytosquelette utilisés dans les thérapies du cancer vers le traitement des maladies neurologiques. Dans cette ligne, des molécules sélectionnées seront testées sur des astrocytes de souris DM1, afin de fournir une preuve de principe de la capacité à améliorer la morphologie cellulaire par la manipulation chimique de la stabilité et de la dynamique du cytosquelette. La caractérisation phénotypique et moléculaire de la structure et de la dynamique du cytosquelette dans les astrocytes de souris DM1 (objectif 1) guidera la sélection rationnelle des molécules approuvées à tester dans l'objectif 3, en termes de cible et de fonction. 4. Validation dans des modèles tissulaires et cellulaires humains. Lorsque l'on travaille avec des modèles animaux, il est important de s'assurer que les nouvelles connaissances acquises sont pertinentes pour la maladie humaine. Nos résultats moléculaires et cellulaires seront validés sur des échantillons de tissu cérébral humain DM1 déjà collectés et disponibles dans le laboratoire hôte (14 DM1 et 9 contrôles). Les anomalies structurelles du cytosquelette seront étudiées par immunofluorescence à haute résolution sur des coupes de cerveau humain. En résumé, ce projet permettra de mieux comprendre la biologie moléculaire et cellulaire fondamentale de la maladie cérébrale DM1, tout en indiquant de nouvelles voies thérapeutiques possibles. 1. Ashizawa,T. et Sarkar,P.S. (2011) Myotonic dystrophy types 1 and 2. Handb. Clin. Neurol. 101, 193-237. 2. Meola,G. et Sansone,V. (2007) Cerebral involvement in myotonic dystrophies. Muscle and Nerve, 36, 294-306. 3. Braz,S.O., Acquaire,J., Gourdon,G. et Gomes-Pereira,M. (2018) Des souris et des hommes : Avancées dans la compréhension des aspects neuromusculaires de la dystrophie myotonique. Front. Neurol. 9, 519. 4. Gomes-Pereira,M., Foiry,L., Nicole,A., Huguet,A., Junien,C., Munnich,A. et Gourdon,G. (2007) CTG trinucleotide repeat 'big jumps' : De grandes expansions, de petites souris. PLoS Genet, 3, 0488-0491. 5. Huguet,A., Medja,F., Nicole,A., Vignaud,A., Guiraud-Dogan,C., Ferry,A., Decostre,V., Hogrel,J.Y., Metzger,F., Hoeflich,A., et al. (2012) Molecular, Physiological, and Motor Performance Defects in DMSXL Mice Carrying > 1,5 million de dollars. DMSXL portant >1 000 répétitions CTG du locus DM1 humain. PLoS Genet, 8, e1003043. 6. González-Barriga,A., Lallemant,L., Dincã,D.M., Braz,S.O., González-Barriga,A., Lallemant,L., Dincã,D.M., Braz,S.O., Polveche,H., Magneron,P., et al. (2021) Integrative cell type-specific multi-omics approaches reveal impaired programs of glihoods. (2021) Les approches multi-omiques intégratives spécifiques des types cellulaires révèlent des programmes altérés de différenciation des cellules gliales dans des modèles de culture de souris atteints de DM1. Front. Cell. Neurosci., (Soumis). 7. Dincã,D.M., Gonzalez-Barriga,A., Sicot,G., Lallemant,L., Pillet,L.-E., Cresto,N., Braz,S.O., Polveche,H., Huguet-Lachon,A., Azotla-Vilchis,C.N., et al. (2021) Myotonic dystrophy RNA toxicity alters morphologie, l'adhésion et la migration des astrocytes de la souris et de l'homme. (En cours de révision). 8. Lasser,M., Tiber,J. et Lowery,L.A. (2018) The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Front. Cell. Neurosci. 12.

Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a life-threatening, multisystemic disorder. DM1 prevalence is estimated at 1/3,000- 1/8,000 individuals worldwide, making it the most common form of muscular dystrophy in adults (1). In addition to typical muscle symptoms, the central nervous system (CNS) is critically compromised by debilitating cognitive impairment and behavioural changes, which have a tremendous impact on the quality of life of patients and their families (2). DM1 is caused by the abnormal expansion of a non-coding trinucleotide DNA repeat in the 3'UTR of the DMPK gene. DMPK transcripts carrying non-coding CUG repeats accumulate in nuclear aggregates (or RNA foci), disturbing the activity of important RNA-binding proteins, which control alternative splicing, among other aspects of RNA metabolism (3). Despite progress in the understanding of molecular pathogenesis in muscle, the intermediate molecules and pathways driving the neurobiology of the disease remain largely unknown, slowing down the development of effective therapies targeting the CNS. We previously generated a transgenic mouse model of DM1 that provides a useful tool to investigate the molecular pathogenesis of disease (4, 5). Using these mice, we have collected evidence of pronounced astrocyte abnormalities in response to the DM1 mutation. In particular, global RNA sequencing and phophoproteomics analysis of primary astrocytes derived from these mice revealed abnormalities in cytoskeleton-related transcripts and proteins (6). Cytoskeleton dysfunction was further supported by the reduced, disorganised actin filaments and erratic migration of cultured astrocytes from DM1 mice (7). Astrocytes are highly ramified, and their function depends intimately on the role of the cytoskeleton to maintain complex cell morphologies. The cytoskeleton is highly dynamic, going through cycles of polymerisation and depolymerisation regulated by cytoskeleton regulating proteins. Cytoskeleton turnover is critical for nervous system development and maintenance, cell migration and response to injury. It is not surprising that mutations in cytoskeleton components and regulators have been found in multiple neurological diseases (8) It is my hypothesis that DM1 affects cytoskeleton organisation and dynamics. To test the involvement of cytoskeleton dysfunction in DM1 brain disease, this project will take advantage of a unique DM1 mouse, to address the following aims: 1. Investigation of cell morphology, cytoskeleton structure and dynamics . Improved microscopy and analysis methods will be implemented to fully characterise and quantify the consequences of the DM1 repeat expansion on the cellular morphology of DM1 mouse astrocytes. High resolution fluorescent methods will be used to determine the cytoskeleton organisation, turnover and dynamics in DM1 mouse astrocytes in culture. This task will benefit from the collaboration with research scientists in the host institute with strong expertise in cytoskeleton biology and live cell imaging. 2. Molecular validation of RNA-sequencing and proteomics. To uncover the molecular mechanisms behind the cellular and cytoskeleton phenotypes, the phenotypic characterisation DM1 mouse cells will be complemented by the molecular analysis of relevant disease intermediates identified in our previous RNA sequencing and phosphoproteomics approaches. Quantitative differences in gene expression will be studied by quantitative RT-PCR and western blot, while splicing defects will be confirmed by RT-PCR. Abnormal protein phosphorylation will be confirmed by western blot immunodetection with phospho-specific antibodies, or by 2D electrophoresis in collaboration with the SU P3S Proteomics Platform (https://www.p3s.sorbonne-universite.fr/ ). 3. Assessment of cytoskeleton modifying chemical strategies. The realisation that cytoskeleton disruption plays a central role in neurological diseases opened up the possibility to benefit from the repositioning of cytoskeleton chemical modifiers used in cancer therapies to the treatment of neurological diseases. In this line, selected molecules will be tested on DM1 mouse astrocytes, to provide proof-of-principle demonstration of the capacity to ameliorate cell morphology through chemical manipulation of cytoskeleton stability and dynamics. The phenotypic and molecular characterisation of cytoskeleton structure and dynamics in DM1 mouse astrocytes (Aim 1) will guide the rational selection of approved molecules to test in Aim 3, in terms of their target and function. 4. Validation in human tissue and cell models. When working with animal models it is important to ensure that the new insights gained are relevant to human disease. Our molecular and cellular findings will be validated in human DM1 brain tissue samples already collected and available in the host laboratory (14 DM1 and 9 controls). Structural cytoskeleton abnormalities will be studied by high-resolution immunofluorescence on human brain sections In summary, this project will provide new insight into the fundamental molecular and cell biology of DM1 brain disease, while pointing towards new possible therapeutic routes. 1. Ashizawa,T. and Sarkar,P.S. (2011) Myotonic dystrophy types 1 and 2. Handb. Clin. Neurol., 101, 193–237. 2. Meola,G. and Sansone,V. (2007) Cerebral involvement in myotonic dystrophies. Muscle and Nerve, 36, 294–306. 3. Braz,S.O., Acquaire,J., Gourdon,G. and Gomes-Pereira,M. (2018) Of Mice and Men: Advances in the understanding of neuromuscular aspects of myotonic dystrophy. Front. Neurol., 9, 519. 4. Gomes-Pereira,M., Foiry,L., Nicole,A., Huguet,A., Junien,C., Munnich,A. and Gourdon,G. (2007) CTG trinucleotide repeat ‘big jumps': Large expansions, small mice. PLoS Genet., 3, 0488–0491. 5. Huguet,A., Medja,F., Nicole,A., Vignaud,A., Guiraud-Dogan,C., Ferry,A., Decostre,V., Hogrel,J.Y., Metzger,F., Hoeflich,A., et al. (2012) Molecular, Physiological, and Motor Performance Defects in DMSXL Mice Carrying >1,000 CTG Repeats from the Human DM1 Locus. PLoS Genet., 8, e1003043. 6. González-Barriga,A., Lallemant,L., Dincã,D.M., Braz,S.O., González-Barriga,A., Lallemant,L., Dincã,D.M., Braz,S.O., Polveche,H., Magneron,P., et al. (2021) Integrative cell type-specific multi-omics approaches reveal impaired programs of glial cell differentiation in mouse culture models of DM1. Front. Cell. Neurosci., (Submitted). 7. Dincã,D.M., Gonzalez-Barriga,A., Sicot,G., Lallemant,L., Pillet,L.-E., Cresto,N., Braz,S.O., Polveche,H., Huguet-Lachon,A., Azotla-Vilchis,C.N., et al. (2021) Myotonic dystrophy RNA toxicity alters morphology , adhesion and migration of mouse and human astrocytes. (Under revision). 8. Lasser,M., Tiber,J. and Lowery,L.A. (2018) The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Front. Cell. Neurosci., 12.