Étude structurale et fonctionnelle du nucléofilament Rad51 chez S. cerevisiae

Structural and functional study of Rad51 nucleofilament in S. cerevisiae

• Auteur / Autrice : Fadma Lakhal
• Direction : Angela Taddei
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique du noyau
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Compartimentation et dynamique des fonctions nucléaires

Mots clés

Mots clés libres

Recombinase Rad51

Recombinaison homologue

Réparation ADN

Rad51 recombinase

Homologous recombination

DNA repair

Résumé

La recombinaison homologue (RH) est l'une des voies principales de réparation des cassures double brin. Ces lésions de l'ADN peuvent apparaître de manière spontanée ou suite à l'action d'agents endommageant l'ADN. Chez les eucaryotes, la recombinase Rad51 joue un rôle central dans la RH en formant un filament nucléo-protéique (FNP) autour de l'ADN simple brin afin de pouvoir scanner le génome, trouver et envahir une séquence homologue qui va servir de copie pour la réparation de l'ADN endommagé. La RH est essentielle pour maintenir l'intégrité du génome ainsi que pour générer sa diversité mais elle peut aussi mener à une instabilité génomique et à la mort cellulaire dans certains cas. En effet, une RH imprévue ou excessive peut générer des filaments de Rad51 toxiques. De plus, trouver une homologie par le biais de la RH est risqué et peut facilement être sujet à des erreurs, surtout dans les cas où la chromatide sœur est absente. Chez les cellules mammifères, la RH est essentielle à la viabilité cellulaire bien qu'elle intervienne moins fréquemment que la voie de réparation NHEJ (Non Homologous End Joining) pour réparer les cassures double-brin. Cependant des études ont montré que la RH joue un rôle fondamental dans la carcinogenèse et la progression du cancer. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes régulant la formation et la stabilité des filaments Rad51 ce qui sera l'objectif principal de ce doctorat. Bien que Rad51 ai été largement étudiée notamment in vitro par des approches moléculaires et génétiques, ses dynamiques in vivo n'ont pas pu être évaluées car aucun tag de la protéine n'était fonctionnel. L'équipe Taddei a récemment développé et caractérisé la première version entièrement fonctionnelle de Rad51 chez S. cerevisiae, permettant ainsi de suivre la formation de filaments de l'ordre du micron après l'induction d'une cassure double brin unique. Ces filaments adoptent des formes différentes et sont très dynamiques : ils subissent des cycles de compaction/ré-extension permettant une exploration efficace du volume nucléaire en quête d'une séquence homologue. Cela dévoile un nouveau mécanisme de recherche d'homologie afin d'assurer une recherche robuste et efficace. Ces observations ouvrent de nombreuses questions dont certaines que je vais aborder durant ce doctorat notamment : la caractérisation des structures formées par Rad51 in vivo, l'étude des dynamiques et des formes du filament pendant la recherche d'homologie/l'invasion du brin homologue ainsi que l'identification des facteurs les régulant.

Homologous recombination (HR) is one of the main pathways to repair DNA double strand breaks (DSB) occurring either spontaneously or upon induction by DNA damaging agents. In eukaryotes, the recombinase Rad51 plays a central role in HR by forming nucleoprotein filaments (NPF) on single-stranded DNA (ssDNA) to scan the genome and invade a homologous sequence used as a template for DNA repair synthesis. HR is essential to maintain genome stability and to generate genetic diversity, but it can also lead to genome instability and cell death. Particularly, excessive, or unscheduled HR can generate toxic Rad51 filaments. Also, finding a homology through HR is risky and could easily be prone to errors, especially in the absence of a sister chromatid. In mammalian cells, it is a known fact that HR is less prevalent than NHEJ pathway (Non-Homologous End Joining) yet it is essential for cell viability. Furthermore, evidence has shown that it also plays a fundamental role in carcinogenesis and the progression of cancer. It is thus essential to decipher the mechanisms regulating the formation and stability of Rad51 filaments, which is the main goal of this PhD. Although Rad51 has been extensively studied by in vitro, molecular, and genetic approaches, its dynamics in vivo could not be assessed due to the lack of functional tagged versions of this protein. The Taddei team has recently developed and characterized the first fully functional version of Rad51 in budding yeast allowing to monitor the formation of micrometer long filaments following the induction of a unique DSB. These filaments adopt different shapes and are highly dynamic with frequent collapse events followed by re-extension, allowing an efficient exploration of the nuclear space in quest of a homologous sequence. This unveils a new mechanism of homology search to ensure robust and efficient search. These observations leave many open questions some of which I will address during this PhD including the characterization of the structures formed by Rad51 in vivo, the study of the dynamics and shapes of the filament upon homology search/strand invasion and identifying the factors regulating them.