Caractérisation et identification de modulateurs de l'internalisation productive des oligonucléotides antisens : application à MGMT dans le glioblastome

Characterization and identification of antisense oligonucleotides productive cellular uptake modulators : application on MGMT in glioblastoma

• Auteur / Autrice : Alexandre Khuu
• Direction : Ahmed Idbaih
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Inscription en doctorat le 01/06/2022; Soutenance le 05/09/2025
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut du cerveau (Paris ; 2009-....)

Mots clés

Mots clés libres

Oligonucléotide antisens

Glioblastome

Internalisation prouductive

Mgmt

Antisense oligonucleotide

Glioblastoma

Productive uptake

Mgmt

Résumé

Le glioblastome (GBM) est un cancer cérébral agressif, où la réparation de l'ADN médiée par l'enzyme O(6)-MethylGuanine-DNA-MethylTransferase (MGMT), constitue un mécanisme de résistance à la chimiothérapie par témozolomide (TMZ). La réduction de l'expression de MGMT représente une stratégie prometteuse pour augmenter l'efficacité du TMZ. Les oligonucléotides antisens (ASO) ont déjà été utilisés avec succès pour réduire l'expression de cibles thérapeutiques dans des maladies neurologiques et métaboliques et ont montré des signes d'efficacité en oncologie. Aucun ASO n'est encore approuvé pour le GBM. Dans des lignées cellulaires de GBM, nous montrons qu'un ASO ciblant l'ARNm MGMT (ASO-MGMT) induit le knock-down de MGMT et augmente la sensibilité cellulaire au TMZ. Cependant en conditions gymnotiques (sans agent de transfection), l'ASO-MGMT perdait son activité, soulignant la faible internalisation cellulaire de l'ASO-MGMT en l'absence d'agent de transfection. Aussi, pour comprendre et améliorer les mécanismes d'internalisation productive des ASO (pénétration intracellulaire aboutissant à l'activité des ASO), nous avons utilisé un ASO ciblant l'ARNlnc MALAT1 (ASO-MALAT1) comme outil. Nos résultats révèlent une hétérogénéité de l'internationalisation productive de l'ASO-MALAT1 en fonction des lignées cellulaires. Nous avons ensuite mis en place un criblage par siRNA pour identifier des protéines modulatrices de l'internalisation productive de l'ASO-MALAT1. Ce criblage a permis d'identifier COPE, une sous-unité du complexe COPI impliquée dans le transport Golgi-RE, et CXCR4, un récepteur aux chimiokines, comme inhibiteurs de l'activité de l'ASO-MALAT1. Le knock-down de ces protéines a entraîné une modification de la distribution subcellulaire de l'ASO-MALAT1 et une augmentation de son activité. De manière intéressante, l'association entre le knock-down de COPE et l'ASO-MGMT a augmenté : (i) l'activité de l'ASO-MGMT en conditions gymnotiques, (ii) le knock-down de MGMT, et (iii) l'efficacité antitumorale du TMZ dans les cellules de GBM. L'ensemble de nos résultats révèlent de nouvelles voies d'internalisation productive des ASO dont la modulation permet d'améliorer l'activité biologique et thérapeutique des ASO dans les modèles de GBM.

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain cancer in which DNA repair mediated by MGMT is a key mechanism of resistance to the chemotherapy drug temozolomide (TMZ). Reducing the expression of O(6)-Methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) represents a promising strategy to enhance TMZ efficacy. Antisense oligonucleotides (ASOs) have been successfully used to reduce protein expression in neurological and metabolic disorders and have shown signs of efficacy in oncology. To date, no ASO has been approved for GBM. In our work, we demonstrate that an ASO targeting MGMT mRNA (ASO MGMT) can significantly reduce MGMT mRNA and protein levels, thereby enhancing TMZ efficacy. However, under gymnotic conditions (i.e., without transfection agent), ASO-MGMT activity is lost, highlighting a major limitation of ASO-based therapies due to unproductive cellular uptake. To overcome this limitation, we used an ASO targeting the lncRNA MALAT1 (ASO-MALAT1) as a tool to investigate the relationship between ASO activity and subcellular distribution across various cancer cell lines. Our results reveal distinct internalization profiles, improved by transfection agents, that allow preferential ASO localization to the nucleus and cytosol. We then conducted an siRNA screen to identify proteins involved in productive ASO-MALAT1 uptake. This screen identified COPE, a subunit of the COPI complex involved in Golgi-ER trafficking, and CXCR4, a chemokine receptor, as negative regulators of ASO-MALAT1 activity. Inhibiting these proteins led to increased ASO-MALAT1 activity and altered its subcellular distribution. When applied to ASO-MGMT, COPE inhibition enhanced: (i) ASO-MGMT activity under gymnotic conditions, (ii) MGMT knock-down, and (iii) the anti-tumor efficacy of TMZ in GBM cells. Together, our findings reveal novel pathways of productive ASO internalization and propose an innovative strategy to modulate these pathways to improve ASO activity. Targeting these mechanisms may represent a promising approach for future therapeutic development.