Étude des mécanismes moléculaires de la réplication des grands réplicons secondaires chez Vibrio cholerae.

Investigating the Molecular Mechanisms of Replication of Large Secondary Replicons in Vibrio cholerae

• Auteur / Autrice : Noa Guzzi
• Direction : Marie-Eve Kennedy-val, Bianca Sclavi
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Microbiologie et immunologie
• Date : Inscription en doctorat le 02/10/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique des génomes
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Plasticité du Génome Bactérien

Mots clés

Mots clés libres

Microbiologie

Génétique

Biologie cellulaire

Omics

Microbiology

Genetics

Cellular Biology

Omics

Résumé

Le projet de doctorat proposé vise à étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le maintien de multiples réplicons de grande taille chez les bactéries, comme Vibrio. Les Vibrio, possédant deux chromosomes circulaires (Chr1-3Mbp et Chr2-1Mbp), sert de paradigme pour les 10 % de bactéries qui ont une structure génomique multipartite. Récemment, des souches pathogènes de Vibrio possédant un troisième réplicon de la même taille que Chr2 (Chr3-1Mbp) ont été découvertes, ce qui offre de nouvelles possibilités d'étudier l'évolution du génome de Vibrio et sa structure multipartite. L'objectif de ce projet est d'étudier le contrôle de la réplication de Chr3 dans l'agent pathogène Vibrio cholerae et de comprendre comment elle est maintenue de façon stable à travers les générations, ouvrant la voie à son assimilation en tant que composant permanent du génome bactérien. bactérien. Le projet sera co-supervisé par le Dr Marie-Eve Val et le Dr Bianca Sclavi, qui partagent un intérêt pour le contrôle de la réplication bactérienne sous différentes perspectives. Bianca se concentre sur l'étude des oscillations de l'expression des gènes au cours du cycle cellulaire. Elle a observé des oscillations dans la production et l'activité de l'initiateur de réplication DnaA d'Escherichia coli au niveau d'une seule cellule, et sa corrélation avec le cycle cellulaire. Marie-Eve se concentrent sur les mécanismes régissant le maintien coordonné de plusieurs chromosomes au cours du cycle cellulaire. Elle a montré qu'un mécanisme unique de point de contrôle coordonne la réplication du Chr2 de Vibrio avec le système de régulation bien réglé de Chr1 piloté par DnaA. Chr3 possède un système d'initiation de la réplication apparenté à celui de Chr2. Des données préliminaires montrent que Chr3 est maintenu de manière stable à une copie par cellule, ce qui indique l'existence d'un mécanisme de contrôle. L'origine de réplication de Chr3 contient une surreprésentation de motifs de méthylation Dam, ce qui suggère que la réplication de Chr3 est sous le contrôle de la méthylation Dam et de la SeqA, comme pour Chr1 et Chr2. Une autre observation frappante est que la réplication de Chr3 est 1,8 fois plus rapide que celle de Chr1 et Chr2, qui ont des vitesses de réplication égales. De plus, Chr3 code pour ses propres sous-unités de l'holoenzyme PolIII, l'hélicase réplicative, la polymérase I, la ligase A et les ribonucléosides réductases, qui régulent le pool de dNTP. Il s'agit d'une découverte inhabituelle, car les plasmides détournent généralement la machinerie de réplication de leurs hôtes. Les objectifs du projet proposé sont d'évaluer si la maintenance de Chr3 est coordonnée avec le cycle cellulaire de l'hôte,identifier les gènes et les éléments régulateurs impliqués dans l'initiation de la réplication de Chr3 et dans le contrôle du nombre de copies, caractériser l'initiateur de réplication de Chr3 (RctC) à la lumière de ce que nous avons appris sur l'initiateur apparenté de Chr2 (RctB), et d'étudier le rôle des gène de réplisome présent sur Chr3 dans le cycle cellulaire (par exemple, dnaB, dnaE, dnaQ...) et de la ribonucléotide réductase (par exemple, nrdA, nrdB) et leur impact sur la réplication de l'hôte. Le projet bénéficiera de l'expertise et des méthodologies des deux superviseurs, y compris l'ingénierie des mutants Vibrio, l'analyse des populations à l'aide d'approches de séquençage de l'ADN à haut débit telles que Marker FrequencyMarker Frequency Analysis, ChIP-seq, Tn-seq (Marie-Eve Val), ainsi que l'analyse unicellulaire en utilisant la microscopie à fluorescence couplée à la microfluidique, et l'expertise dans l'interaction des protéines et l'expression des gènes régulés par le cycle cellulaire (Bianca Sclavi).

The proposed PhD project aims to investigate the molecular mechanisms involved in maintaining multiple large replicons in bacteria, with a focus on Vibrio. The Vibrio family, which has two circular chromosomes (Chr1-3Mbp and Chr2-1Mbp), serves as the paradigm for the 10% of bacteria that have a multipartite genomic structure (1). Recently, pathogenic strains of Vibrio with a third replicon of the same size as Chr2 (Chr3-1Mbp) have been discovered, providing new opportunities to explore Vibrio genome evolution and integration of the maintenance of a massive new replicon into the cell cycle. The objective of this project is to study the control of Chr3 replication in the Vibrio cholerae pathogen and to understand how it is stably maintained across generations, paving the way for its assimilation as a permanent component of the bacterial genome. The project will be co-supervised by Dr. Marie-Eve Val and Dr. Bianca Sclavi, who share an interest in bacterial replication control from different perspectives. Bianca's research focuses on studying gene expression oscillations during the cell cycle. She has observed oscillations in the Escherichia coli replication initiator DnaA production and activity at the single-cell level, and its correlation with cell volume (2). Marie-Eve's research focuses on the mechanisms governing the cell-cycle coordinated maintenance of multiple chromosomes. She has shown that a unique checkpoint mechanism coordinates Vibrio Chr2 replication with the well-tuned DnaA-driven regulatory system of Chr1 (3). Chr3 has a replication initiation system related to that of Chr2. Preliminary data show that Chr3 is stably maintained at one copy per cell, indicating a control mechanism that limits Chr3 replication to once per cell cycle. The origin of replication of Chr3 contains an over-representation of Dam-methylation motifs, suggesting that Chr3 replication is under the control of Dam methylation and SeqA origin sequestration, similar to Chr1 and Chr2. Another striking observation is that the replication of Chr3 is 1.8 times faster than Chr1 and Chr2, which have equal replication speeds. Chr3 encodes its own Pol III holoenzyme subunits, replicative helicase, Polymerase I, Ligase A, and ribonucleoside reductases, which regulate the pool of dNTPs (4). This is an unusual finding since plasmids typically hijack the replication machinery of their hosts. The objectives of the proposed project are to assess whether Chr3 maintenance is coordinated with the host cell cycle, identify the genes and regulatory elements involved in Chr3 replication initiation and copy number control, characterize Chr3 replication initiator (RctC) in light of what we have learned on the related Chr2 initiator (RctB) (5), and study the role of Chr3-encoded replisomes genes (e.g., dnaB, dnaE, dnaQ...) and ribonucleotide reductase (e.g., nrdA, nrdB) and their impact on the host replication. The project will benefit from both supervisors' expertise and methodologies, including Vibrio mutant engineering, population analysis using high-throughput DNA sequencing approaches such as Marker Frequency Analysis, ChIP-seq, Tn-seq (Marie-Eve Val), as well as single-cell analysis using fluorescence microscopy coupled with microfluidics, high-throughput image analysis, and expertise in protein interaction and cell-cycle regulated gene expression (Bianca Sclavi).