Le rôle du GDF5 dans la modulation des macrophages dans la maintenance de la masse et de la fonction musculaire au cours du vieillissement

Role of GDF5 on Macrophages modulation in the maintenance of muscle mass and function during ageing

• Auteur / Autrice : Maxime Gelin
• Direction : Sestina Falcone
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Myologie
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Muscle mass and function maintenance and optimization of AAV-based gene therapies

Mots clés

Mots clés libres

Gdf5

Macrophages

Muscle âgé

Régénération musculaire

Gdf5

Macrophages

Aged muscle

Muscle regeneration

Résumé

Notre objectif est de décrypter les interactions entre le GDF5 et les macrophages (Mφs) dans le maintien de la masse et de la fonction musculaire au cours du vieillissement naturel et après une lésion associée à l'inflammation. Pour atteindre cet objectif, nous étudierons les points suivants: Objectif 1 : Effet du GDF5 sur la prolifération/polarisation des Mφs (in vitro). Le rôle du GDF5 dans la modulation du phénotype inflammatoire M1 ou anti-inflammatoire M2φ n'est pas bien connu. Pour établir son effet, indépendamment des autres acteurs présents dans le muscle adulte, nous évaluerons : i) Le rôle direct du GDF5 sur des Mφs fraîchement isolés en traitant des Mφs primaires de souris de type sauvage (WT) avec différentes doses de GDF5 recombinant (rGDF5) ou de véhicule (Veh) pendant 24h, 48h ou 72h. ii) L'effet paracrine du GDF5, exprimé par les cellules musculaires différenciées, sur les Mφs, en co-culturant des Mφs WT et des cellules musculaires primaires différenciées de souris témoins ou GDF5 Knock-Out (KO). Pour les deux études, le taux de prolifération des Mφs sera quantifié à l'aide d'un kit de viabilité cellulaire (CyQUANTTM) et le ratio M1/M2 sera déterminé par cytométrie de flux. Ces expériences permettront d'élucider le rôle du GDF5 sur la polarisation M1/M2φ. Objectif 2 : Rôle de Mφs dans l'hypertrophie induite par le GDF5 dans le muscle âgé. L'altération du système immunitaire au cours de la fonte musculaire liée à l'âge a été établie par plusieurs travaux, bien que le rôle des cellules M1/M2φs soit complexe et mal compris. Afin d'évaluer l'impact de ces cellules sur l'effet protecteur du GDF5 sur le muscle âgé, nous proposons d'élucider leur interaction dans différentes conditions : i) Pour établir le rôle de Mφs dans les bénéfices du GDF5 sur le muscle âgé, nous déplèterons les Mφs lors de la surexpression du GDF5 (OE). La surexpression de GDF5 sera obtenue en injectant des souris WT âgées avec AAV1-Scr ou -GDF5 dans le Tibialis Anterior (TA). Pour induire la mort apoptotique des Mφs, la moitié de ces animaux sera administrée avec des liposomes de Clodronate ou de véhicule. Dans ces conditions, nous évaluerons si la déplétion des Mφ a un impact sur la masse musculaire, la morphologie et la force. Les résultats de ces analyses indiqueront le rôle de M1/M2φs dans les effets protecteurs du GDF5 au cours du vieillissement, ses effets sur la distribution de M1/M2φs et sur l'expression des cytokines pro-/anti-inflammatoires dans le muscle squelettique in vivo. Objectif 3 : Effet de la modulation des macrophages par le GDF5 au cours de la régénération musculaire chez les souris âgée. L'importance du GDF5 dans la réparation musculaire n'a jamais été étudiée. Nous émettons l'hypothèse qu'il pourrait avoir une fonction de guérison par la régulation de l'inflammation et de la polarisation Mφ. Pour approfondir cette compréhension, nous injecterons des souris âgées témoins et des souris GDF5 KO avec AAV1-GDF5 ou -Scr dans le TA. 4 semaines après l'injection de l'AAV, les souris subiront une lésion musculaire induite par la cardiotoxine, qui est décrite comme induisant une inflammation. Nous utiliserons de jeunes souris WT et GDF5 KO comme contrôle. Nous évaluerons: i) La génération de force dans le TA, le poids musculaire et la surface transversale des fibres, 3, 7 et 15 jours après l'injection. ii) M1/M2φs comme décrit dans l'objectif 2. En perspective, notre étude devrait permettre de découvrir des stratégies ayant un potentiel thérapeutique pour contrer le déclin musculaire et rééquilibrer les acteurs de la réponse immunitaire, ce qui pourrait être appliqué à une pléthore de conditions pathologiques ayant un impact sur un nombre croissant de personnes dans le monde.

Our objective, here, is to decipher the cross-talk between GDF5 and macrophages (Mφs) in the maintenance of aged muscle mass and function during natural ageing and after inflammation-associated injury. To achieve this objective we will investigate: Aim1: Effect of GDF5 on Mφs proliferation/polarization (in vitro). The role of GDF5 in the modulation of inflammatory M1 or anti-inflammatory M2φ phenotype is not well-known. To establish its effect, independently of other players present in adult muscle, we well assess: i) The direct role of GDF5 on freshly isolated Mφs by treating wild-type (WT) primary mouse Mφs with different doses of recombinant GDF5 (rGDF5) or vehicle (Veh) for 24h, 48h or 72h. ii) The paracrine effect of GDF5, expressed by differentiating muscle cells, on Mφs by co-culturing WT Mφs and primary differentiated muscle cells from control or GDF5 Knock-Out (KO) mice. For both studies, Mφs proliferation rate will be quantified using cell viability kit (CyQUANTTM) and M1/M2 ratio will be determined by flow cytometry. These experiments will elucidate the role of GDF5 on M1/M2φ polarization. Aim2: Role of Mφs in GDF5-induced hypertrophy in aged muscle. Immune system impairment during age-related muscle wasting has been established by several works, though the role of M1/M2φs is complex and poorly understood. To assess the impact of these cells on the protective effect of GDF5 on aged muscle, we propose to elucidate their cross-talk in different conditions: i) To establish the role of Mφs in GDF5 benefits on aged muscle, we will deplete Mφs upon GDF5 overexpression (OE). GDF5 OE will be obtained by injecting aged WT mice with AAV1-Scr or -GDF5 in Tibialis Anterior (TA). To induce apoptotic death of Mφs, half of these animals will be administered with Clodronate or vehicle liposomes. In this condition, we will evaluate if Mφ exhaustion impacts muscle mass, morphology, and force. Results from these analyses will indicate the role of M1/M2φs in the protective effects of GDF5 during ageing, its effects on M1/M2φs distribution and on pro-/anti-inflammatory cytokine expression in skeletal muscle in vivo. Aim3: Effect of GDF5 modulation of macrophages during muscle regeneration in aged mice. The relevance of GDF5 on muscle repair has never been investigated. We hypothesize that it could have a healing function by the regulation of inflammation and Mφ polarization. To expand this understanding, we will inject aged control and GDF5 KO mice with AAV1-GDF5 or -Scr in TA. 4 weeks after AAV injection, mice will undergo cardiotoxin-induced muscle injury, which is described to induce inflammation. We will use young WT and GDF5 KO as control. We will evaluate: i) TA force generation, muscle weight and cross-sectional area of fibers, 3, 7 and 15 days after injection. ii) M1/M2φs as described in Aim2. In perspective, our study would lead to unravel strategies having therapeutic potential to counteract muscle decline and rebalance immune response players which could be applied to a plethora of pathologic conditions impacting increasing number of people worldwide.