Décision quantitative et engagement dans l'apoptose

Quantitative decision and apoptosis engagement

• Auteur / Autrice : Tom Cumming
• Direction : Romain Levayer
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie du développement et cellules souches
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Mort cellulaire et homéostasie des épithéliums

Mots clés

Mots clés libres

Apoptose

Caspase

Développement

Apoptosis

Caspase

Development

Résumé

Bien que la plupart des voies régulant la division et la mort cellulaires soient connues, les facteurs modulant la probabilité qu'une cellule s'engage dans l'apoptose sont mal caractérisés. Jusqu'à présent, les études sur l'apoptose se sont principalement concentrées sur la régulation des caspases par des signaux intracellulaires et extracellulaires en amont. Cependant, récemment des études ont mis en évidence de nombreuses fonctions non apoptotiques des caspases. Par ailleurs, de nouveaux outils chez la drosophile ont permis de décrire l'activation ubiquitaire de caspases qui ne sont pas toujours associées à la mort cellulaire. L'imagerie live de senseurs de caspases dans le notum de la pupe de drosophile (l'épithélium du thorax de la mouche) a révélé de nombreux événements d'activation de caspases qui ne conduisent pas à la mort cellulaire. Cela suggère que l'engagement dans l'apoptose est un processus de décision complexe et que les caspases effectrices n'agissent pas comme de simples interrupteurs binaires. En outre, l'équipe du Dr Levayer a récemment découvert qu'il n'existe pas de seuil spécifique d'activation des caspases effectrices associé à la mort cellulaire dans le notum pupal et que les cellules s'engagent dans l'apoptose à des niveaux très variables de caspase. L'ensemble de ces résultats suggère que des facteurs inconnus peuvent moduler la sensibilité des cellules à l'activation des caspases et influencer la probabilité qu'elles entrent en apoptose. Par conséquent, il existe un nouveau niveau de régulation de l'apoptose situé en aval des caspases effectrices qui n'a pas été explorée jusqu'à présent. Ce projet aura pour but de caractériser de nouveaux facteurs et voies modulant la sensibilité cellulaire à l'activation des caspases en combinant l'imagerie quantitative live, l'optogénétique, des cribles et l'analyse d'images. Les facteurs qui modulent la sensibilité aux caspases et la probabilité d'entrer en apoptose peuvent jouer un rôle critique au cours du développement pour basculer entre les fonctions non-apoptotiques et apoptotiques des caspases. Ils peuvent également être des cibles pertinentes pour sensibiliser les cellules tumorales à l'apoptose malgré les mutations des voies en amont modulant l'activité des caspases. Nous établirons d'abord une carte spatiale de la sensibilité à optoDronc (un outil optogénétique permettant d'activer la caspase-9 de la drosophile avec de la lumière bleue) dans le notum de la pupe. Nous mesurerons la probabilité d'élimination des cellules dans les différentes régions du tissu après une légère activation des caspases. Nous réaliserons ensuite un RNAseq après triage cellulaire et/ou TaDa (targeted DamID) en utilisant les drivers Gal4 disponibles afin de comparer les profils transcriptionnels des régions sensibles à la caspase avec le reste du tissu. Cela nous permettra d'identifier les modulateurs putatifs de la sensibilité aux caspases. Pour tester les régulateurs possibles de la sensibilité aux caspases, nous utiliserons optoDronc et évaluerons systématiquement la vitesse d'élimination des clones lors de l'exposition à la lumière bleue. Le knockdown de diverses voies (candidats identifiés par RNAseq) sera effectué par RNAi. La combinaison de l'induction clonale d'ARNi et de l'induction des caspases par la lumière donne l'occasion unique de coupler le moment de la déplétion d'un gène d'intérêt avec le moment de l'induction des caspases. Pour les candidats dont la déplétion ralentit ou accélère l'élimination des cellules, nous vérifierons s'ils modifient les niveaux d'activité des caspases associés à l'engagement dans l'extrusion/apoptose (en utilisant une image en direct de l'activité des caspases avec GC3Ai). Nous vérifierons également s'ils affectent la vitesse d'extrusion. Enfin, nous tenterons de caractériser le mécanisme putatif par lequel les candidats modulent l'engagement dans l'apoptose en vérifiant s'ils interagissent directement avec les caspases et s'ils peuvent affecter la localisation des caspases et/ou la localisation de substrats clés

While most of the pathways regulating cell division and cell death are known, factors modulating the probability that an individual cell will commit to apoptosis are not well characterised. Studies of apoptosis so far have primarily focused on the regulation of caspase enzymes by upstream intracellular and extracellular signals. However, recent studies have outlined the numerous nonapoptotic functions of caspases, and novel tools in Drosophila have depicted ubiquitous activation of caspases which are not always associated with cell death. Live imaging of caspase sensors in the Drosophila pupal notum (the epithelium of the fly thorax) has also revealed many caspase activation events which do not lead to cell death. This suggests that engagement in apoptosis is a complex decision process and that effector caspases do not act as simple binary switches. Furthermore, Dr. Levayer's team recently found that there is no specific threshold of effector caspase activation associated with cell death in the pupal notum, and that cells engage in apoptosis at highly variable levels of caspase. Altogether, these results suggest that unknown factors can modulate the sensitivity of cells to caspase activation and influence the probability that they will enter apoptosis. Therefore, there is a new layer of regulation of apoptosis located downstream of effector caspases which has not been explored so far. This thesis will seek to characterize new factors and pathways modulating cellular sensitivity to caspase activation by combining quantitative live imaging, optogenetics, screening and image analysis. Factors which modulate sensitivity to caspases and the probability to enter apoptosis may play a critical role during development to switch between non-apoptotic and apoptotic functions of caspases. They may also be relevant targets to sensitize tumoural cells to apoptosis despite the mutations of upstream pathways modulating caspase activity. We will first establish a spatial map of sensitivity to optoDronc (an optogenetic tool which allows activation of Drosophila caspase-9 with blue light) in the pupal notum, by measuring the probability of cell elimination in the different regions of the tissue after mild caspase activation. We will then perform RNAseq after cell sorting and/or TaDa (targeted DamID) using available Gal4 drivers to compare the transcriptional profiles of caspase-sensitive regions with the rest of the tissue. This will allow us to identify putative modulators of caspase sensitivity. To test possible regulators of caspase sensitivity, we will use optoDronc and systematically assess the speed of clone elimination upon blue light exposure. Knockdown of various pathways (candidates identified by RNAseq) will be performed through RNAi. The combination of clonal induction of RNAi and light induction of caspases gives the unique opportunity to couple the timing of depletion of a gene of interest with the timing of induction of caspases. For candidate gene products whose depletion slows down or accelerates cell elimination, we will check whether they alter the levels of caspase activity associated with the engagement in extrusion/apoptosis (using live image of caspase activity with GC3Ai). We will also check whether they affect the speed of extrusion. Eventually, we will try to characterise the putative mechanism by which candidates modulate engagement in apoptosis by checking if they directly interact with caspases and whether they can affect caspase localisation and/or the localisation of key substrates.