Améliorations fab-ouleuses pour la Cryo-EM

Fab-oulous improvements for Cryo-EM

• Auteur / Autrice : Carla Cabal fernandez
• Direction : Massimiliano Bonomi
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Inscription en doctorat le 04/04/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie moléculaire structurale et processus infectieux
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Bioinformatique structurale

Mots clés

Mots clés libres

Cryo-microscopie electronique

Biologie Structurale

Biologie computationelle

Dynamique moléculaire

Anticorps

Cryo-electron microscopy

Structural Biology

Computational Biology

Molecular Dynamics

Antibodies

Résumé

La cryo-microscopie électronique (Cryo-EM) est une technique puissante utilisée pour déterminer la structure de macromolécules biologiques. Toutefois, résoudre la structure de protéines de petite taille, dynamiques et asymétriques reste un défi. Dans notre projet, on vise à améliorer la résolution des structures des protéines à l'aide d'une plateforme rigide générée à partir des antigen-binding fragments (Fabs) des anticorps monoclonaux. Ainsi, nous prendrons le Trastuzumab et le Pertuzumab comme modèles. Une approche combinant la biochimie des protéines et la bio-informatique est envisagé. Dans un premier temps, nous réduirons la flexibilité de la région du coude du fab avec plusieurs stratégies : mutations ponctuelles de certains acides aminés, introduction de ponts disulfure, interaction avec des nanobodies ou insertion d'un peptide cyclique dans la cavité du Fab. Les approches permettant la plus grande stabilité seront combinées et testées par diffraction des rayons X et nanoDSF entre autres. Par ailleurs, des algorithmes seront développés pour améliorer notre compréhension de la dynamique de la protéine en partant des cartes Cryo-EM à basse résolution. Une structure de haute résolution des 2 Fabs en complexe avec le récepteur Her2 sera finalement obtenue par Cryo-EM.

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) is a powerful technique used to determine the structure of biological macromolecules However, dynamic, small and highly asymmetrical proteins remain a challenge. In our project, we aim at improving resolution of protein structures by building a rigid scaffold from the antigen-binding fragment (Fab), using Trastuzumab and Pertuzumab monoclonal antibodies as models. A combined approach between protein biochemistry and structural bioinformatics is envisaged. On the one hand, flexibility of the fab elbow region will be reduced 2 following different strategies: amino acid point mutations, introduction of disulfide bonds, nanobody binding or insertion of a cyclic peptide in the cavity of the Fab. The most stabilizing approaches will be combined and tested by x-ray crystallography and nanoDSF. On the other hand, algorithms will be developed in order to better understand protein dynamics from low-resolution cryo-EM maps. A high- resolution structure of the 2 Fabs complexed to the Her2 receptor will be obtained by Cryo-EM.