Etude biochimique de UbiU-UbiV d'Escherichia coli, deux enzymes 4Fe-4S impliquéesdans une réaction d'hydroxylation anaérobe préphénate-dépendante

Biochemical study of UbiU-UbiV from Escherichia coli, two 4Fe-4S enzymes involvedin a prephenate-dependent anaerobic hydroxylation reaction

• Auteur / Autrice : Roache Arulanandam
• Direction : Marc Fontecave
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Moléculaire
• Date : Inscription en doctorat le 02/10/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie moléculaire de Paris Centre
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de chimie des processus biologiques

Mots clés

Mots clés libres

UbiU-UbiV

Anaérobe

Hydroxylation

Préphénate-dépendante

UbiU-UbiV

Anaerobic

Hydroxylation

Prephenate-dependent

Résumé

L'ubiquinone est une petite molécule lipophile impliquée dans des transferts d'électrons dans la chaîne respiratoire aérobie de tous les êtres vivants. Sa biosynthèse aérobie implique de nombreuses protéines, environ une douzaine chez E.coli (1-4) dont sept forment un complexe multi-protéique stable appelé métabolon Ubi. Très récemment, nous avons découvert que cette biosynthèse a lieu également en l'absence d'oxygène et que cette biosynthèse anaérobique implique des protéines à centres [4Fe-4S] dont le rôle est encore mal connu à ce jour (5,6). Ces protéines, appelées UbiU et UbiV, forment un complexe protéique hétérodimérique (1 :1) et seraient impliquées dans la catalyse de réactions d'hydroxylation sur le noyau aromatique de la quinone. Le donneur d'atome d'oxygène serait le préphénate (7). Les substrats naturels de ces enzymes ne sont pas commerciaux, et nous développons au laboratoire la synthèse d'analogues de substrats à plus courte chaîne terpénique (Farnésyl = 3 unités isoprényles) dont certains ont déjà été synthétisés au laboratoire (Farnésyl Phénol) La thèse comportera deux volets : - un volet centré sur l'étude biochimique et mécanistique de cette nouvelle classe d'enzymes hydroxylases à centres [4Fe-4S], avec : (i) la mise au point d'un test in vitro, (ii) la détermination des paramètres enzymatiques (Km/Vm), (iii) la régiosélectivité du système, (iv) la détermination des potentiels redox des centres Fe-S, (v) l'identification de l'oxydant biologique nécessaire à cette réaction d'oxydation, (vi) la détermination du rôle redox d'un acide aminé clé (Tyrosine 228 d'UbiU), (vii) l'étude structurale par cristallographie aux RX du complexe UbiU-UbiV. - un volet de chimie bio-organique centré sur la synthèse d'analogues de substrats de UbiU-UbiV, ainsi que d'analogues non aromatisables du préphénate, ces derniers pouvant servir d'inhibiteurs des enzymes UbiU-UbiV. L'objectif du projet sera donc double : 1) la compréhension structurale et fonctionnelle d'une nouvelle classes d'hydroxylases à centres [4Fe-4S] préphénate-dépendante, au niveau moléculaire et 2) la synthèse et le développement d'inibiteurs de ces enzymes qui pourraient servir d'antibiotiques pour les bactéries pathogènes Pseudomonas aeruginosa. Ce projet financé par l'ANR PRC 2023 est réalisé en collaboration avec deux équipes de recherche : l'une à Grenoble (Dr. Ludovic Pelosi, TIMC, Equipe TrEE, UMR5525), l'autre à l'Institut Pasteur (Pr. Frédéric Barras, Adaptation au stress et Métabolisme chez entérobactéries, UMR6047) Les techniques utilisées pour répondre à ces objectifs sont les techniques de biologie moléculaire (mutagénèse dirigée), production et purification de protéines (FPLC), spectroscopie UV-visible, tests enzymatiques (HPLC), cristallographie de protéines sous atmosphère inerte (boîtes à gants au laboratoire), chimie organique. La laboratoire possède tous les équipements nécessaires pour ces éudes. La spectrocopie RPE sera réalisée en collaboration avec une équipe du CEA Grenoble. L'étudiant aura donc, au cours de sa thèse, l'opportunité de traiter des questions scientifiques très diverses de biochimie enzymatique (détermination de paramètres enzymatiques), biochimie structurale (cristallogénèse et résolution de structure, programmes de modélisation moléculaire et de docking), ainsi que de chimie organique. Le contenu très disciplinaire de ce projet constitue une excellente base pour une formation par la recherche en biochimie et chimie bio-organique

Ubiquinone (UQ) is an essential small lipophilic molecule involved in electron transfer in the aerobic respiratory chain of all living organisms. Its aerobic biosynthesis involves a large number of proteins. Very recently, it was discovered that in anaerobic bacteria and in some facultative aerobes, this biosynthesis occurs even without oxygen and involves the [4Fe-4S] proteins, UbiU and UbiV. They are responsible for the hydroxylation reactions on the aromatic ring of the quinone, with prephenate serving as the source of the oxygen atom. The study of this newly discovered O2-independent ubiquinone biosynthetic pathway will allow us to unveil an unprecedented mechanism of anaerobic insertion of an O atom into a -CH bond, in a prephenate dependent manner, and provide a new pathway to target within the scope of antimicrobial approaches. Indeed, the obtained mechanistic knowledge will be used to develop potential selective inhibitors of this anaerobic UQ biosynthetic pathway in pathogenic bacteria, using Pseudomonas aeruginosa as a model