Caractérisation structurale et fonctionnelle de la protéine non structurelle 3 du virus Chikungunya

Structural and functional characterisation of Chikungunya virus non-structural protein 3

• Auteur / Autrice : Andrei Karpov
• Direction : Juan Reguera, Ignacio Casuso
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé: Biochimie structurale
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : AFMB - Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : AFMB - Complexes Macromoléculaires Viraux

Mots clés

Mots clés libres

Virus du Chikungunya

Caractérisation structurelle

Organites viraux

Chikungunya virus

Structural characterization

Viral organelles

Résumé

Le virus Chikungunya (CHIKV), un agent pathogène transmis par les moustiques, infecte des milliers de personnes chaque année, provoquant de la fièvre, de l'arthrite, des éruptions cutanées et, dans certains cas, des issues fatales. Malgré cela, un vaccin efficace reste insaisissable, soulignant la nécessité de comprendre les mécanismes de réplication virale pour le développement de thérapies. Le génome de ce virus, constitué d'un ARN simple brin à polarité positive, est répliqué par un complexe de réplication viral (CR), composé de quatre protéines non structurales (nsP1 à nsP4). La nsP3, qui comporte trois domaines bien définis – un macrodomaine (MD), un domaine unique aux alphavirus (AUD) et un domaine hypervariable (HVD) – est essentielle pour la réplication virale, bien que son mécanisme d'action reste encore flou. Des recherches récentes au sein de notre équipe ont révélé que nsP3 agit comme une protéine échafaudage, capable de s'assembler en échafaudages hélicoïdaux (HS) via son AUD lors de l'infection par le CHIKV. Nous avons élucidé sa structure en Cryo-EM à une résolution de 2,3 Å. Ici, je présente une étude de mutagenèse centrée sur la compréhension des déterminants moléculaires de l'assemblage des HS. L'interaction de nsP3 avec les ARN viraux a été analysée à l'aide d'essais de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA), démontrant de fortes interactions avec la région 5'UTR de l'ARN génomique du CHIKV. Les données suggèrent que des ARN plus longs entraînent des complexes protéine-ARN plus stables, mais les interactions avec des nsP3 mutants et d'autres ARN restent non concluantes, ce qui indique la nécessité d'une optimisation des protocoles. L'interaction entre nsP3 et G3BP1/2 a été étudiée à l'aide de la biocapteur à couches minces (BLI), où une forte liaison avec les nsP3_WT monomériques et oligomériques a été observée, mais aucune interaction n'a été détectée avec la variante nsP3_Y200A. Une augmentation de l'épaisseur de la biocouche lorsque nsP3_WT libre a été ajouté à la protéine immobilisée dans des conditions de faible salinité a été interprétée comme une oligomérisation, mais une confirmation supplémentaire est nécessaire. Le Cryo-EM a été utilisé pour explorer les changements structurels, révélant des structures variables dans les HS de nsP3_WT et des altérations de symétrie dans un mutant. En outre, des homologues de nsP3 d'autres virus ont été purifiés, et des structures tubulaires ont été observées pour nsP3 du virus Sindbis (SINV) et du virus de l'encéphalite équine de l'Est (EEEV), tandis qu'aucun comportement similaire n'a été détecté pour les homologues du virus Mayaro (MAYV) et du virus Ebola (EBOV). En résumé, ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur les interactions et les caractéristiques structurelles de nsP3 du CHIKV, jetant ainsi les bases pour les prochaines années de cette thèse de doctorat.

Chikungunya virus (CHIKV), a mosquito-borne pathogen, infects thousands of people yearly, causing fever, arthritis, rash, and some deathly cases. Despite this, an effective vaccine remains elusive, underscoring the need to understand viral replication mechanisms for therapeutic development. The positive-sense single-stranded RNA genome of the virus is replicated by a viral replication complex (RC), comprising four non-structural proteins (nsP1 to 4). nsP3 has three defined domains, a macrodomain (MD), an alphavirus unique domain (AUD) and a hypervariable domain (HVD), and is important for viral replication although its mechanism of function is elusive. Recent research within our team revealed that nsP3 is a scaffolding protein able to assemble into helical scaffolds (HSs) through its AUD during CHIKV infection. We elucidated its Cryo-EM structure at 2.3 Å resolution. Here, I will present a mutagenesis study focused on the understanding of the molecular determinants of the HS assembly. Binding of nsP3 to viral RNAs was analysed using electromobility shift assays (EMSA), and strong interactions with the 5'UTR of CHIKV gRNA were demonstrated. The data suggested that longer RNAs result in stronger protein-RNA complexes, but interactions with mutated nsP3s and other RNAs remain inconclusive, indicating a need for protocol optimisation. The interaction between nsP3 and G3BP1/2 was studied using bio-layer interferometry (BLI), where strong binding with monomeric and oligomeric nsP3_WT was observed, but no interaction was detected with the nsP3_Y200A variant. An increase in the thickness of the biolayer when free nsP3_WT was added to immobilised protein under low salt conditions was considered as oligomerisation, but further confirmation is required. Cryo-EM was applied to explore structural changes, revealing variable structures in nsP3_WT HSs and symmetry alterations in a mutant. Additionally, homologs of nsP3 from other viruses were purified, and tubular structures were observed for Sindbis virus (SINV) and Eastern equine encephalitis virus (EEEV) nsP3, while no similar behaviour was detected for Mayaro virus (MAYV) and Ebola virus (EBOV) homologs. Overall, these findings provide new insights into CHIKV nsP3 interactions and structural characteristics, laying the groundwork for future years of the PhD.