Études structurales des enzymes du Complexe Réplication /Transcription (RTC) des Coronavirus et des virus à long génome d’ARN

Structural studies of Replication/Transcription Complex (RTC) enzymes of Coronaviruses and long RNA genome viruses

• Auteur / Autrice : Pierre Gauffre
• Direction : François Ferron, Bruno Canard
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé: Biochimie structurale
• Date : Soutenance en 2024
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la vie et de la santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : AFMB - Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : AFMB - Réplicases Virales : Structure Mécanisme et Drug-Design
• Jury : Président / Présidente : Jean Claude Guillemot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Ferron, Sandrine Belouzard, Cédric Leyrat, Hélène Malet, Bruno Coutard, Bruno Canard, Patrice Gouet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sandrine Belouzard, Cédric Leyrat

Mots clés

Mots clés libres

Sras

SRAS-Cov-2

Études structurales

Virus à long génome d’ARN

Virus

Enzymes de virus

Sras

SRAS-Cov-2

Structural studies

Long genome RNA viruses

Virus

Virus enzymes

Résumé

Mon travail de thèse de doctorat se concentre sur l'étude structurale des enzymes (nsp7, nsp8, et nsp12) impliquées dans le complexe de réplication et transcription (RTC) des coronavirus, notamment SARS-CoV, SARS-CoV-2 et MERS-CoV, ainsi que sur d'autres virus à long génome d'ARN. Le RTC est essentiel pour la transcription des ARNm viraux et la réplication du génome, ce qui en fait une cible prioritaire pour le développement d'antiviraux. Le premier chapitre détaille les méthodes et stratégies d'optimisation de la production et de la purification des enzymes du RTC pour chacun des trois virus, en mettant un accent particulier sur le MERS-CoV. Ces travaux ont permis de reconstituer in vitro ce complexe et de développer une caractérisation précise des mécanismes structuraux et fonctionnels des RTC de ces virus. Ils ont notamment contribué à la caractérisation d'un analogue nucléotidique, comme l'AT-9010 qui cible la nsp12 du SARS-CoV-2. Le deuxième chapitre aborde la caractérisation structurale par cristallographie de trois méthyltransférases issues de différents virus. La première étude porte sur la résolution d'un complexe entre la méthyltransférase NS5 de la dengue et l'AT-9010, afin de caractériser ce potentiel inhibiteur. La seconde concerne l'étude structurale de la première N7-méthyltransférase virale d’un virus à ARN+ identifiée dans un locus inhabituel du génome d'un Nidovirales. La troisième caractérisation examine la nsp14 de SARS-CoV-2 en complexe avec un anticorps à domaine unique, visant à stabiliser cette enzyme flexible. NSP14 possède une méthytransferase N7 non canonique ainsi qu'un domaine exoribonucléase. Cette enzyme joue un rôle clé dans la correction des erreurs de réplication et la protection des ARN viraux, représentant ainsi une cible stratégique pour le développement d'inhibiteurs. Les résultats cristallographiques sont complétés par diverses analyses biophysiques, enzymatiques et structurales, notamment par des techniques de SEC-SAXS. En conclusion, mon travail de thèse vise à approfondir notre compréhension des mécanismes d'action des enzymes du RTC des coronavirus, et a permis de mettre en évidence de nouveaux modes d'action d'un inhibiteur potentiel contre ces différents virus. Mes résultats ouvrent des perspectives prometteuses pour le développement de thérapies ciblées contre ces virus, contribuant potentiellement à la lutte contre de futures pandémies.

My doctoral research focuses on the structural study of enzymes (nsp7, nsp8, and nsp12) involved in the replication and transcription complex (RTC) of coronaviruses, including SARS-CoV, SARS-CoV-2, and MERS-CoV, as well as other long RNA genome viruses. The RTC is essential for the transcription of viral mRNAs and genome replication, making it a priority target for antiviral development. The first chapter details the methods and strategies for optimizing the production and purification of RTC enzymes for each of the three viruses, with particular emphasis on MERS-CoV. This work enabled the in vitro reconstitution of the complex and the precise characterization of the structural and functional mechanisms of the RTCs of these viruses. Notably, it contributed to the characterization of a nucleotide analog, such as AT-9010, which targets nsp12 of SARS-CoV-2. The second chapter addresses the structural characterization by crystallography of three methyltransferases from different viruses. The first study involves resolving the complex between the dengue virus NS5 methyltransferase and AT-9010 to characterize this potential inhibitor. The second study pertains to the structural analysis of the first viral N⁷-methyltransferase from a positive-sense RNA virus identified in an unusual locus within a Nidovirales genome. The third characterization examines SARS-CoV-2 nsp14 in complex with a single-domain antibody aimed at stabilizing this flexible enzyme. NSP14 possesses a non-canonical N⁷ methyltransferase domain as well as an exoribonuclease domain. This enzyme plays a key role in replication error correction and protection of viral RNA, thus representing a strategic target for inhibitor development. The crystallographic results are complemented by various biophysical, enzymatic, and structural analyses, including SEC-SAXS techniques. In conclusion, my doctoral research aims to deepen our understanding of the mechanisms of action of RTC enzymes in coronaviruses and has highlighted new modes of action of a potential inhibitor against these various viruses. My results open promising prospects for the development of targeted therapies against these viruses, potentially contributing to the fight against future pandemics.