Mise au point d'un modèle d'édition du génome par saturation pour étude de l'impact fonctionnel de variations ponctuelles.

Saturation genome editing for evaluation of single nucleotide variations functional impact

• Auteur / Autrice : Simon Boussion
• Direction : Florence Petit
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie - MED
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Maladies Rares du Développement embryonnaire et du Métabolisme : du Phénotype au Génotype et à la Fonction

Mots clés

Mots clés libres

Edition du génome par saturation

Variants ponctuels

Vriants de signification inconnue

Cellules haploïdes HAP1

CRISPR/Cas9

Librairie de variants

Saturation Genome Editing

Single Nucleotide Variation

Variant of Unknown Significance

Haploïd Cells HAP1

CRISPR/Cas9

Variants library

Résumé

La généralisation du séquençage à haut débit (NGS ou Next Generation Sequencing) a permis une considérable amélioration des capacités de diagnostic étiologique des pathologies génétiques. Le NGS a cependant confronté les biologistes à la problématique de l'identification de variants de signification inconnue (VSI), dont le nombre augmente de manière intrinsèquement liée à l'utilisation de cette technique. Les biologistes disposent d'outils de prédiction in silico permettant de les guider dans l'interprétation des variants, mais leur apport est limité et tous les variants d'interprétation non évidente ne peuvent pas faire l'objet de tests fonctionnels en routine. Depuis quelques années, une nouvelle génération de tests fonctionnels multiplexés sont mis au point et permettent d'étudier de nombreux variants de manière simultanée. Parmi elles, les techniques d'édition du génome par saturation (Saturation Genomic Edition ou SGE) utilisent l'outil CRISP-Cas9 pour introduire, dans une séquence génique codante donnée, l'intégralité des variants ponctuels possibles (librairie de variants). Il s'agit d'un outil puissant pour tester l'impact in vitro d'un nombre important de variants en une unique expérience, à condition que le gène testé soit essentiel à la survie cellulaire et que le mécanisme de la pathologie soit la perte de fonction. L'objectif de ce travail de thèse est de mettre au point au laboratoire RADEME – ULR7364 la technique d'édition du génome par saturation, afin de tester in vitro l'impact fonctionnel de l'intégralité des variants ponctuels des régions codantes de plusieurs gènes d'intérêt. Pour chaque exon d'un gène étudié, nous concevons d'une part un sgRNA guide permettant de cibler l'action de Cas9 et une librairie d'oligo-nucléotides comprenant chacun un variant ponctuel de la séquence cible, afin d'insérer par recombinaison homologue tous les variants ponctuels possibles de l'exon étudié. Des cellules haploïdes HAP1 sont co-transfectées avec un plasmide contenant le gène de la Cas9 et le sgRNA, et un plasmide contenant les oligo-nucléotides. L'ADN génomique des cellules HAP1 est extrait à plusieurs temps précis de culture après transfection. L'ADN génomique extrait à chaque étape est séquencé en NGS haute profondeur. La représentativité de chaque variant par rapport à l'ensemble des lectures est mesurée. L'évolution de ces proportions au fil du temps pour chaque variant permet d'évaluer la survie cellulaire et donc la pathogénicité de chaque variant. Nous nous attendons à identifier un impact fonctionnel fortement délétère pour les variants non-sens, du fait du mécanisme de pathogénicité par perte de fonction des gènes d'intérêt, et un impact faible des variants synonymes. Les résultats les moins prévisibles et les plus attendus concerneront les variants faux-sens, qui sont les plus difficiles à interpréter et qui constituent la majorité des VSI. Nous appliquerons en premier lieu notre test par SGE au gène MED13L, dont les variants pathogènes hétérozygotes sont responsables, par haploinsuffisance, d'un trouble du neuro-développement évoluant vers la déficience intellectuelle (MIM#616789), d'hérédité autosomique dominante. Les variants pathogènes connus de MED13L sont des variants tronquants mais aussi des variants faux-sens, ce qui en fait un bon candidat au test de SGE. Nous appliquerons ensuite cette approche à d'autres gènes d'intérêt. La finalité du travail est d'obtenir une cartographie de l'impact fonctionnel in vitro de l'ensemble des variants ponctuels possibles des régions codantes de MED13L et des autres gènes d'intérêt qui seront étudiés, y compris ceux n'ayant encore jamais été décrits en pathologie humaine. Au-delà de l'augmentation de leur rendement par rapport aux tests fonctionnels classiques, la capacité d'anticipation de la pathogénicité des variants, et l'amélioration de l'interprétation des variants en diagnostic, constitue le véritable apport scientifique des tests fonctionnels par SGE.

Next Generation Sequencing (NGS) generalization has significanlty enhanced diagnostic performances of genetic pathologies etiology. However, NGS led molecular biologists to confront the challenge of variants of unknown significance (VUS) identification, whose numbers inherently increase with the use of this technique. Many in silico prediction tools are available to assist the molecular biologists in the interpretation process of VUS, but their contribution is limited, and not all VUS can undergo routine functional testing. For several years, a new generation of multiplexed functional test has emerged and allow the simultaneous study of numerous variants. Among them, Saturation Genome Editing (SGE) techniques use the CRISPR-Cas9 tool to introduce, into a given coding genomic sequence, every single nucleotide variation (SNV), forming a variants library. This is a powerful tool to assess in vitro the functional impact of a large number of variants with a single experiment, as long as the tested gene is essential for cell survival and the physiopathological mechanism of the pathology is loss of function. The aim of this research project is to develop, in the RADEME – ULR 7364 laboratory, the SGE technique, in order to evaluate in vitro the functional impact of every coding SNV of several genes of interest. For each exon of a studied gene, we design a sgRNA to target Cas9 action, and an oligonucleotides library which each carries a SNV from the target sequence, in order to introduce, by homology directed repair, every SNV of the studied exon. Haploïd HAP1 cells are co-transfected with a plasmid containing Cas9 sequence and the sgRNA, and a plasmid containing oligonucleotides. Genomic DNA is harvested from transfected HAP1 cells at several precise timepoints after transfection. Genomic DNA harvested at each timepoint is sequenced using targeted high-depth NGS. The representativeness of each variant relative to the total reads is measured. Monitoring the proportions of each variant over time allows the evaluation of cell survival and thus the pathogenicity of each variant. We expect to indentify a strong deleterious functional effect for nonsense variants, due to the loss of function physiopathological mechanism of the genes of interest, and a neutral or weak impact of synonym variants. The less predictable and the most expected results will concern missense variants, which are the most difficult to interprete and constitute the majority of VUS. We will apply the SGE experiment firstly to MED13L gene, of which heterozygous pathogenic variants lead, through haploinsufficiency, to a neurodevelopmental disorder progressing to intellectual disability (MIM#616789), with autosomal dominant heredity. Already known pathogenic variants of MED13L include truncative variants, but also missense variants, making it a suitable candidate for SGE test. We will apply later this approach to other genes of interest. The ultimate aim of this research work is to obtain a map of in vitro functional impact of all coding SNV of MED13L and other genes of interest, including those not yet described in human disease. Beyond their increased efficiency compared to traditional functional tests, the capacity to anticipate the pathogenicity of variants and improve their interpretation in diagnostic, constitute the real scientific contribution of SGE functional tests.