Développement d’un biosenseur fluorescent d’uranyle pour la surveillance environnementale

Development of a fluorescent uranyl biosensor for the environmental monitoring

• Auteur / Autrice : Nicolas Jans-robinson
• Direction : Catherine Berthomieu, Sandrine Sauge-merle
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Biotechnologie
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 06/02/2025
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences du Vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : BIAM - Institut de Biosciences et Biotechnologies d'Aix-Marseille - CEA/CNRS/AMU
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : BIAM - IPM - interactions protéine métal
• Jury : Président / Présidente : Hélène Javot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Berthomieu, Claude Alban, Jean Aupiais, Sandrine Sauge-merle, Maria-Rosa Beccia
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Claude Alban, Jean Aupiais

Mots clés

Mots clés libres

Biosenseur

Uranyle

Fluorescence

Biodisponibilité

Criblage

Fret

Biosensor

Uranyl

Fluorescence

Bioavailability

Screening

Fret

Résumé

L'uranium est un radionucléide naturellement retrouvé dans l'environnement, mais également à la suite d’activités humaines (cycle du nucléaire, exploitation minière, utilisation d'engrais et d'armement). La forme la plus stable de l'uranium en solution aqueuse est le cation uranyle UO22+. Il peut être chélaté par divers ions et protéines et peut affecter la santé de nombreux organismes, dont l'homme. La concentration maximale d’uranium établie par l'OMS dans l'eau potable est de 30 μg/L. Par conséquent, la surveillance environnementale est un domaine de recherche essentiel, tant du point de vue environnemental que sanitaire. Les techniques utilisées aujourd'hui pour la détection de l'uranium en solution aqueuse mesurent la concentration totale de l'uranium, qui diffère de sa fraction biodisponible, définie comme la quantité capable de pénétrer dans un organisme vivant. Il n'existe actuellement aucun système capable de détecter la fraction biodisponible de l'uranium, qui est estimée par des approches théoriques. Les biosenseurs, définis comme des « instruments analytiques combinant une composante biologique et une composante physico-chimique », constituent une alternative aux méthodes de détection habituelles. Parmi les différents types de biosenseurs, les biosenseurs « cellule entière » peuvent détecter la fraction biodisponible d'un composé. Un biosenseur d'uranyle (SF1) inspiré d'un biosenseur de calcium a été développé au sein de l’équipe, l'IPM. Il est constitué d’une calmoduline modifiée pour fixer l’uranyle fusionnée à deux protéines fluorescentes (FP) et peut détecter des concentrations micromolaires d’uranyle de façon ratiométrique par une approche de transfert de fluorescence (FRET) entre les deux FP. Au cours de ce projet, nous avons cherché à exprimer ce biosenseur chez le poisson zèbre Danio rerio, dans l’optique de développer un outil capable de détecter l'uranium biodisponible dans l'eau par une approche d’édition du génome en ciblant trois gènes, sans succès. Par ailleurs, nous avons cherché à améliorer l’affinité du biosenseur SF1 pour l’uranyle. Pour ce faire, nous avons d’une part travaillé à l’expression du biosenseur SF1 au niveau de la membrane externe d’E. coli dans l’optique de développer une méthode de criblage à haut débit. La protéine a bien été exprimée au niveau de la membrane mais il persiste une variabilité en réponse à l’uranyle à optimiser pour développer un crible fiable associé. D’autre part, nous avons amélioré l’affinité du site II de la CaM pour l’uranyle par la modification des résidus en position 2 et 3 suivie du criblage des mutants produits. Ces travaux ont permis d’identifier des variants de la CaM présentant une affinité pour l’uranyle améliorée par rapport à la protéine de départ. Ces résultats ont permis à l’équipe de générer les biosenseurs correspondants et leur caractérisation a mis en évidence une réponse améliorée en termes d’amplitude de signal et de sensibilité.

Uranium is a radionuclide found naturally in the environment, but also as a result of human activities (nuclear cycle, mining operations, use of fertilizers and weapons). The most stable form of uranium in aqueous solution is the uranyl cation UO22+. It can be chelated by various ions and proteins, and can affect the health of many organisms, including humans. The maximum concentration of uranium in drinking water established by the WHO is 30 μg/L. Environmental monitoring is therefore an essential area of research, both from an environmental and a health point of view. The techniques used today to detect uranium in aqueous solution measure the total concentration of uranium, which differs from its bioavailable fraction, defined as the quantity capable of entering a living organism. There are currently no systems capable of detecting the bioavailable fraction of uranium, which is estimated by theoretical approaches. Biosensors, defined as “analytical devices combining a biological and a physico-chemical component”, offer an alternative to conventional detection methods. Among the different types of biosensors, “whole cell” biosensors can detect the bioavailable fraction of a compound. A uranyl biosensor (SF1) inspired by a calcium biosensor has been developed within the IPM group. It consists of a calmodulin modified to bind uranyl fused to two fluorescent proteins (FPs) and can detect micromolar concentrations of uranyl ratiometrically by fluorescence transfer (FRET) between the two FPs. During this project, we sought to express this biosensor in the zebrafish Danio rerio, with the goal of developing a tool capable of detecting bioavailable uranium in water using a genome editing approach targeting. Three genes were targeted, without success. We also sought to improve the affinity of the biosensor SF1 for uranyl. We worked on the expression of the biosensor in the outer membrane of E. coli, with the aim of developing a high-throughput screening method. We were able to express the protein in the outer membrane, but a variability in the uranyl response remains. This aspect needs to be optimized to develop a reliable screening tool. We also improved the affinity of CaM site II for uranyl by modifying residues in positions 2 and 3, followed by screening of the mutants produced. This work enabled us to identify CaM variants with improved affinity for uranyl compared with the starting protein. These results enabled the team to generate the corresponding biosensors, and their characterization revealed an improved response in terms of signal amplitude and sensitivity.