Suivi du développement neuronal par microscopie de front d'onde

Monitoring neuronal development using wavefront microscopy

• Auteur / Autrice : Baptiste Marthy
• Direction : Guillaume Baffou, Maxim Cazorla
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : PHYSIQUE & SCIENCES DE LA MATIERE - Spécialité : OPTIQUE, PHOTONIQUE ET TRAITEMENT D'IMAGE
• Date : Inscription en doctorat le 02/10/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Physique et sciences de la matière (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut FRESNEL - Sciences et Technologies de l'Optique, l'Electromagnétisme, et l'Image

Mots clés

Mots clés libres

Imagerie de front d'onde

Neurone

Microfluidique

Wavefront imaging

Neuron

Microfluidics

Résumé

L'interférométrie à décalage quadrilatéral (ID4L) est une technique de microscopie de front d'onde permettant une observation haute-résolution de cellules biologiques en culture. Les images permettent une mesure de la masse de cellule individuelle purement optique et non-invasive. Les neurones immatures produisent des projections cellulaires, appelées neurites. Après quelques jours de culture, les neurites se différencient en dendrite ou en axone. Dans de précédents travaux, il a été démontré que l'ID4L peut mesurer la masse de neurite individuel, avec une résolution sub-picogramme. Cependant, la croissance des neurones sur lame se fait de manière désordonnée et aléatoire, ce qui complique l'analyse des résultats et la répétabilité. Mon projet de thèse consiste à développer une méthodologie robuste, performante et diffusable de l'étude de la vitesse de croissance d'une population de neurones en culture. Les neurones seront cultivés sur une puce microfluidique permettant l'isolement de neurites individuels dans des canaux rectilignes. Cette croissance canalisée facilitera l'identification, la segmentation et la mesure de la masse de neurites. Les mesures seront parallélisées, permettant une répétabilité des mesures sur un seul champ de vu. Ce projet sera porté par deux laboratoires: l'Institut Fresnel, spécialisé en microscopie et l'Institut des Neurosciences de la Timone, spécialisé en neurobiologie et microfluidique. Dans un premier temps, les efforts seront concentrés sur la mise en œuvre de la technique. Le design de la puce, dont l'efficacité a déjà été démontrée dans de précédents travaux, pourra être adapté à l'imagerie de front d'onde. Le microscope accueillera environnement microfluidique et thermostaté. Des codes de calcul seront nécessaires pour l'analyse des images: la mesure de la masse de neurites nécessite une étape de segmentation numérique originale, actuellement semi-automatique. Un travail d'automatisation de la procédure numérique sera mis en œuvre. Enfin, la faisabilité de la technique sera validée sur une population de neurones. Jusqu'ici, seul la masse totale des neurites a été envisagée. Selon les performances de l'outil développé, il sera possible d'étudier des flux massiques au sein des neurites. Des oscillations de la masse totale de neurites au cours du temps ont été observées lors de travaux préliminaires. Ces variations de masse, de l'ordre du picogramme, pourraient être dues à un flux de matière entre le neurite et son soma, le corps cellulaire du neurone. Cet évènement est rare et ténu. Couplé à de l'imagerie de fluorescence, les mesures ID4L pourront expliquer l'origine de ces phénomènes. Une étude des flux massiques au sein de l'axone permettra d'ouvrir les portes sur une nouvelle compréhension de la dynamique de croissance des neurones. La microfluidique offre la possibilité d'introduire des stimuli externes durant la croissance des neurones. Ces stimuli pourront avoir un impact sur la croissance ou les flux de matières des neurones. Grâce aux mesures de masses, il sera possible de quantifier la réaction d'une population de neurones à un stimulus externe. Il est envisagé d'étudier les phénomènes de photobiomodulation: l'accélération de la croissance de neurones par une illumination optique proche infrarouge. Le stimulus pourrait aussi être chimique, composé de protéine ou de molécule pharmaceutique. Enfin, la puce microfluidique comportant des électriques, les neurones pourraient présenter des échanges de masse lors de décharge électrique. Ainsi, cette thèse vise à développer une technique d'imagerie permettant la mesure non-invasive, sans marquage et long terme de la masse d'une population de neurones. Ces mesures seront sensibles, répétables et parallélisées. Le nouvel outil développé sera utilisé pour étudier les flux de matières dans des axones. La réponse cellulaire à une large gamme de stimulations externes sera également investigué.

#type/abstract ## Label-free monitoring of single neural growth dynamics using crossgrating microscopy Cross-grating wavefront microscopy (CGM) is a label-free quantitative phase microscopy technique that enables high-precision, high-sensitivity mapping of the intensity and wavefront profile of a light beam. Applied to biology, CGM measures the dry mass of single cells with sub-picogram sensitivity. It enables the monitoring of cellular growth dynamics over extended periods of time without the limitations associated with conventional labeling techniques. In this contribution, we will describe how CGM can be used to monitor a microfluidic neural cell culture. Single neurite are isolated inside channels. We are interesting in quantify the growth dynamics using the total mass and the organelle trafficking.