Caractérisation fonctionnelle du domaine Macro des Alphavirus:Application comme nouvelle cible pour le développement d'agents anti-viraux.

Functional characterization of the Alphaviruses Macro domain:Application as a new target for the development of anti-viral agents.

• Auteur / Autrice : Jérémie Jamain
• Direction : Nadia Rabah
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biotechnologie
• Date : Inscription en doctorat le 16/10/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences du Vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : AFMB - Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : AFMB - Réplicases Virales : Structure Mécanisme et Drug-Design

Mots clés

Mots clés libres

Alphavirus

Immunité innée

Macro domain

Antiviraux

ADP-ribosylation

Alphaviruses

Macro domain

ADP-ribosylation

Innate immunity

Anti-virals

Résumé

Les Alphavirus possèdent un génome à ARN simple brin positif codant pour des protéines structurelles et non structurelles (nsP 1- 4). Parmi ces nsP, la nsP3 joue un rôle essentiel dans la détermination du tropisme des insectes vecteurs, de la neurovirulence, de la spécificité de l'interaction protéine virale/protéine de l'hôte et de l'évasion immunitaire (1)(2). Il contient trois domaines fonctionnels, dont le domaine Macro (XD) (3). Ce domaine macro peut se lier au mono-ADP-ribose (MAR) ainsi qu'au poly-ADPribose (PAR) sous leur forme libre ou conjuguée à une protéine ou à des substrats d'ARN (4). Les macro-domaines ont également des activités hydrolases telles que l'ADP-ribose 1'' phosphatase, mais aussi des activités de dé-MARylation et de dé-PARylation (5)(6). L'ADP-ribosylation est une modification post-traductionnelle cruciale impliquée dans le processus d'inflammation et la régulation de l'immunité innée. L'ADP-ribosylation contribue à l'établissement d'une réponse antivirale en induisant les interférons de type I (IFN) et en inhibant la traduction et la réplication virale (7)(8). Des études de mutagenèse sur les Macro-domaines viraux ont montré que les activités de dé-MARylation et de dé-PARylation hébergées par ce domaine pourraient bloquer l'ADPribosylation dans les cellules hôtes, favorisant ainsi l'évasion virale (2)(9). L'objectif du projet est de concevoir et de tester des ligands ainsi que des inhibiteurs spécifiques des domaines Macro, de déterminer leur mécanisme d'action (liaison et/ou hydrolyse de l'ADP-ribose) par une caractérisation fonctionnelle et biochimique des domaines Macro des virus du Chikungunya et de l'encéphalite équine vénézuélienne, et de tester les molécules candidates dans les cellules infectées par le virus. Le développement de ce projet s'appuiera sur les objectifs suivants : (i) Mener une étude de mutagenèse ciblant les résidus divergents entre les membres des Alphavirus, afin de mettre en évidence les différences dans leur fonction catalytique en termes de liaison au ligand et d'hydrolyse du substrat. (ii) Évaluer l'effet de ces mutations sur la susceptibilité à l'IFN de type I et l'activation des ISG in cellula. (iii) Sur la base des données structurelles disponibles, tester un ensemble d'inhibiteurs candidats sur des domaines Macro recombinants. (iv) Valider les candidats actifs dans des expériences d'infection sur cellules. Enfin, cette étude contribuera à la compréhension et à la caractérisation fonctionnelle des activités virales impliquées dans l'arrêt des réponses immunitaires innées de l'hôte, une condition préalable au développement de médicaments antiviraux spécifiques aux Alphavirus.

Alphaviruses possess a single positive-stranded genomic RNA coding for structural and non-structural proteins (nsP 1-4). Among alphaviruses nsPs, nsP3 plays a critical role in determining insect vector tropism, neurovirulence, viral vs host protein- protein interaction specificity and viral evasion (1)(2). It contains thee functional modules among which the Macro domain (XD) (3). This Macro domain can bind to mono-ADP-ribose (MAR) and poly-ADP-ribose (PAR) in their free form or conjugated to a protein or RNA substrates (4). Macro domains also carry hydrolase activities such as ADP-ribose 1” phosphate, but also de-MARylation and de-PARylation activities (5)(6). ADP-ribosylation is a crucial regulatory modification implicated in the inflammation process and the regulation of innate immunity. ADP-ribosylation contributes to the establishment of an anti-viral response, by inducing type I interferons (IFN) and inhibiting viral translation and replication (7)(8). Mutagenesis studies on viral Macro domains showed that de-MARylation and de-PARylation activities harbored by this domain might counter ADP-ribosylation in host cells, thereby promoting viral evasion (2)(9). The aim of the present proposal is to design and test specific Macro domain ligands and inhibitors, determine their mechanism of action (ADP-ribose binding and /or hydrolysis) through a functional and biochemical characterization of Chikungunya and Venezuelan equine encephalitis viruses Macro domains, and assay candidate molecules in virus infected cells. The development of this project will rely on the following goals: (i) Conduct a mutagenesis study targeting specifically the divergent residues between Alphavirus members, in order to pinpoint differences in their catalytic function in terms of ligand binding and substrate hydrolysis. (ii) Assess the effect of these mutations on type I IFN susceptibility and ISGs activation in cellula. (iii) Based on the available structural data, test a selected set of candidate inhibitors on recombinant Macro domains. (iv) Validate the active candidates in cell infection experiments. Finally, this study will contribute to the understanding and the functional characterization of viral activities implicated in the shutoff of host innate immune responses, a prerequisite for the development of Alphavirus specific antiviral drugs.