Études structurales et biochimiques de l'activation des spliceosomes

Structural and biochemical studies of spliceosome activation

• Auteur / Autrice : Nikita Sharaev
• Direction : Wojciech Galej
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : laboratoire européen de biologie moléculaire

Mots clés

Mots clés libres

Épissage

Activation du spliceosome

Structure

Inhibition de l'épissage

Cryo-EM

Splicing

Spliceosome activation

Structure

Splicing inhibiotion

Cryo-EM

Résumé

L'épissage pré-ARNm, un processus crucial dans l'expression des gènes, est facilité par le spliceosome, un complexe ribonucléoprotéique (RNP) très complexe. Le spliceosome s'assemble par des interactions étape par étape entre les snRNP U1, U2, U4/U6, U5 et de nombreuses protéines non-snRNP avec la molécule pré-ARNm. Les interactions séquentielles entre les snRNP et leur remodelage ultérieur conduisent à la formation de multiples complexes d'épissage E, A, pré-B, B, Bact, B*, C, C*, P et ILS le long de la voie d'assemblage. Le spliceosome effectue deux réactions de transestérification successives pour éliminer un intron et rejoindre les exons adjacents du pré-ARNm. L'assemblage du spliceosome commence par la liaison de U1 au site d'épissage 5' (5'-SS) et l'amarrage initial du snRNP U2, formant le complexe E. L'intégration stable du snRNP U2, facilitée par son interaction avec le site de branchement au sein de l'intron, conduit à la formation du complexe A. Après avoir intégré le snRNP U2 dans le pré-spliceosome, le snRNA U2 s'associe à la région du point de branchement (BP) du pré-ARNm pour former l'hélice de branche encapsulée dans la protéine SF3B1 du complexe SF3b. Par la suite, le tri-snRNP U4/U6.U5 est recruté et intégré de manière stable dans le spliceosome, formant le complexe précatalytique pré-B, qui contient les cinq snRNP mais ne possède pas le centre actif. Lors de l'activation ultérieure du spliceosome, plusieurs dizaines de facteurs sont échangés, conduisant à la formation du complexe Bact, étape à laquelle le centre catalytique est assemblé mais substrat pour l'étape catalytique – site d'épissage 5' (5' SS) et BP l'adénosine est obstruée par des protéines accessoires et situées à distance les unes des autres. Parallèlement, ou avant cette étape, l'interaction d'appariement de bases entre le 5'-SS du pré-ARNm et le snRNA U1 doit être perturbée pour permettre l'appariement de bases entre U6 et l'extrémité 5' de l'intron. Le spliceosome après le départ de U1 est appelé complexe B. Ce réseau nouvellement formé d'interactions d'ARN impliquant U2, U5, U6 et le pré-ARNm constitue le noyau catalytique du spliceosome. Pour le passage au stade Bact, les snRNA U4/U6 appariés en bases subissent un déroulement, provoquant la libération de U4 et permettant de nouvelles interactions d'appariement de bases entre U2 et U6. Suite à des réarrangements supplémentaires des composants RNP, le complexe B* catalytiquement actif se forme, catalysant la première réaction de transestérification d'épissage. Les progrès récents des méthodes structurales, notamment la cryomicroscopie électronique, ont permis aux chercheurs d'élucider ce processus avec une résolution atomique. Puisque plus d'une centaine de protéines effectuent l'épissage, celui-ci se déroule par étapes consécutives. Beaucoup ont été découverts et décrits avec la technique cryo-EM, mais quelques lacunes subsistent. L'essentiel pour l'étude d'épissage est de bloquer le complexe pour une recherche structurelle ultérieure. Les découvertes de nouvelles façons de bloquer l'épissage conduisent à l'ouverture d'une nouvelle étape de modification des spliceosomes. Le nouvel inhibiteur à petites molécules a été décrit récemment. Ce nouvel inhibiteur, OTS964, est un inhibiteur d'épissage sélectif. Le complexe nouvellement bloqué peut constituer une nouvelle étape d'activation du spliceosome, et mon travail se concentre sur l'obtention de la structure de ce complexe. OTS964 inhibe la CDK11, la kinase, connue pour réguler le cycle cellulaire. L'inhibition de CDK11 à l'aide d'OTS964 a profondément affecté l'épissage et l'expression des gènes. On sait que CDK11 interagit avec les protéines SF3B1 et SF3B3. SF3B1 fait partie du complexe SF3b, qui joue un rôle crucial dans la reconnaissance des points de branchement dès les premiers stades de la formation du spliceosome. SF3B1 subit une phosphorylation lors de l'activation du spliceosome et le traitement OTS964 a diminué la phosphorylation de SF3B1. Ces résultats élucident l'interaction entre CDK11 et SF3B1 et leurs rôles cruciaux dans la régulation de l'épissage. Cela fait de l'OTS964 un instrument parfait pour étudier les détails de l'activation des spliceosomes.

Pre-mRNA splicing, a crucial process in gene expression, is facilitated by the spliceosome, a highly intricate ribonucleoprotein (RNP) complex. The spliceosome assembles through stepwise interactions between U1, U2, U4/U6, U5 snRNPs, and numerous non-snRNP proteins with the pre-mRNA molecule. Sequential interactions between snRNPs and their subsequent remodeling lead to the formation of multiple splicing complexes E, A, pre-B, B, Bact, B*, C, C*, P, and ILS along the assembly pathway. The spliceosome performs two successive transesterification reactions to remove an intron and join the adjacent exons of pre-mRNA. Assembly of the spliceosome begins with the binding of U1 to the 5' splice site (5'-SS) and initial docking of the U2 snRNP, forming the E complex. Stable integration of the U2 snRNP, facilitated by its interaction with the branch site within the intron, leads to the forming of the A complex. After integrating U2 snRNP into the pre-spliceosome, the U2 snRNA pairs with the branch point (BP) region of the pre-mRNA to form the branch helix encapsulated within the SF3B1 protein from the SF3b complex. Subsequently, the U4/U6.U5 tri-snRNP is recruited and stably integrated into the spliceosome, forming the precatalytic pre-B complex, which contains all five snRNPs but lacks the active center. During the subsequent activation of the spliceosome, several dozen factors are exchanged, leading to the formation of the Bact complex, the stage at which the catalytic center is assembled but substrate for the catalytic step – 5' splice site (5' SS) and BP adenosine are occluded by accessory proteins and located at a distance from each other. Concurrently, or before this step, the base-pairing interaction between the pre-mRNA's 5'-SS and the U1 snRNA must be disrupted to allow base-pairing between U6 and the 5' end of the intron. Spliceosome after the leave of U1 is called B complex. This newly formed network of RNA interactions involving U2, U5, U6, and the pre-mRNA constitutes the catalytic core of the spliceosome. For the move to the Bact stage, base-paired U4/U6 snRNAs undergo unwinding, causing the release of U4 and enabling new base-pairing interactions between U2 and U6. Following additional rearrangements of the RNP components, the catalytically active B* complex is formed, catalyzing the first transesterification reaction of splicing. The recent advances in structural methods, especially cryo-electron microscopy, allowed researchers to elucidate this process with atomic resolution. Since more than one hundred proteins perform the splicing, it goes in consecutive stages. Many were discovered and described with the cryo-EM technique, but some white gaps remain. The essential thing for the splicing study is to get stalled complex for later structural research. The findings of new ways to stall splicing lead to the opening of a new stage of spliceosome change. The new small molecule inhibitor was described lately. This new inhibitor - OTS964, is a selective splicing inhibitor. The newly stalled complex can be a new stage of spliceosome activation, and my work is focused on obtaining the structure of this complex. OTS964 inhibits CDK11, kinase, which is known to regulate the cell cycle. Inhibition of CDK11 using OTS964 profoundly affected splicing and gene expression. It is known that CDK11 interacts with SF3B1 and SF3B3 proteins. SF3B1 is a part of the SF3b complex, which plays a crucial role in branch-point recognition at the early stages of spliceosome formation. SF3B1 undergoes phosphorylation during spliceosome activation, and OTS964 treatment diminished SF3B1 phosphorylation. These findings elucidate the interaction between CDK11 and SF3B1 and their crucial roles in splicing regulation. This makes OTS964 a perfect instrument to study the details of spliceosome activation.